【征集】征集各种肿瘤动物模型的建立

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【征集】征集各种肿瘤动物模型的建立

番茄老人

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2008-01-20 20:05

为了方面大家的实验，现向各位战友征集各种肿瘤动物模型的建立。希望大家把自己做过的或熟悉的动物模型的建立方法奉献出来，方法描述尽量描述得详细。跟帖时注明哪种肿瘤模型，包括细胞的量，采用哪种动物，注射的方法，大概的成瘤时间，成瘤的状况等细节。希望大家踊跃参与，我们将来希望能够就这方面汇编成小册子，免费向大家提供。

• 【试贴】过来试贴，呵呵

zhihuiren

敢犯强汉者虽远必诛！
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2008-01-21 08:54

支持版主！

欢迎登录智慧医学网【网上书店】和【考试培训】模拟考场！

• 【转载】《中国组织工程研究与临床康复》（CRTER）2009要比以往做得更好！

番茄老人

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2008-01-21 09:59

谢谢zhihuiren版主的支持

天行键，君子以自强不息地势坤，君子以厚德载物

• 【转载】被SCI收录的《中国神经再生研究（英文版）》(Neural Regeneration Research NRR)杂志

番茄老人

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2008-01-23 02:07

先来第一个：K562裸鼠皮下移植瘤

1.裸鼠的饲养
雌性6-8周龄BALB/C nu/nu 裸鼠，饲养在严格无病原菌的屏障内，饲料、垫料、笼具和饮水均经高压蒸汽灭菌。在严格无病原菌环境中饲养1周后进行肿瘤细胞移植实验。

2.移植瘤模型建立
裸鼠先天无毛、无胸腺、T淋巴细胞功能完全缺乏、对异种移植不产生排斥反应。异种移植后的人体肿瘤细胞在裸鼠体内仍保持原有组织形态、免疫学特点、特有的染色体组型等。接种前24小时对裸鼠进行亚致死剂量照射，照射强度为400cGy。将扩增培养的，处于对数生长期的K562细胞用不含血清的RPMI1640培养基洗一次后，重悬于RPMI1640培养基制成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度到5×107细胞/ml，75%酒精消毒小鼠皮肤，每只于右前肢跟部背侧皮下裸鼠接种1×107细胞/0.2ml，注射时避免在同一个点上，最好分中间和四周五个点注射。

3.肿瘤生成的检测
接种后每日观察皮下肿块大小，每三天一次利用游标卡尺分别测量肿块的最长和最短直径，根据公式V(mm3)=最长直径(mm)X最短直径的平方(mm2)/2计算肿瘤的相对体积，超过500mm3为成瘤标准。从皮下接种到成瘤标准需要3-4周。

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• 【讨论】08年的执考分数线之猜想篇

snowy1860

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2008-02-02 23:35

（一）自发性肿瘤模型

　　实验动物种群中不经有意识的人工实验处置而自然发生的一类肿瘤称之为自发性肿瘤。自发性肿瘤发生的类型和发病率可随实验动物的种属、品系及类型的不同而各有差异。肿瘤实验研究中，一般应当选用高发病率的实验动物肿瘤模型作为研究对象，否则就无法进行研究。当然，低发病率的肿瘤模型也有一定用处，可以用它作为对照。

　　肿瘤实验研究中选用自发性肿瘤型为对象进行研究有一定优点：首先是自发性肿瘤通常比用实验方法诱发的肿瘤与人类所患的肿瘤更为相似，有利于将动物实验结果推用到人：其次是这一类肿瘤发生的条件比较自然，有可能通过细致观察和统计分析而发现原来没有发现的环境的或其它的致癌因素，可以着重观察遗传因素在肿瘤发生上的作用。但应用自发性肿瘤模型也存在一些缺点：肿瘤的发生情况可能参差不齐，不可能在短时间内获得大量肿瘤学材料，观察时间可能较长，实验耗费较大。

　　某个近交品系动物在一定年龄内，可以发生一定比率的某种自发性肿瘤。目前已培育了许多种小鼠自发肿瘤，从肿瘤发生学上看，这些自发瘤与人体肿瘤相似，进行肿瘤发病学和药物筛选等实验应属理想。但由于不易同时获得大批病程相似的自发瘤动物，又因这种肿瘤生长较慢，实验周期相对较长，所以一般很少用于筛药。近年有人应用AKR自发白血病小鼠进行化研究，该小鼠出生后一年半内有高于90%的发病率，曾作为研究人体白血病和淋巴瘤的模型，它对药物的治疗反应类似儿童急性淋巴性白血病。由于病程较长，已用于综合化疗研究药物诱导缓解和维持缓解的最适治疗方案。此肿瘤可用强的松和长春新碱诱导缓解，也可以环磷酰胺和甲基-CCNU诱导缓解，再用阿糖胞苷维持缓解，后者疗效最好。自发肿瘤多数为病毒性，如C3H小鼠出生后有高的乳腺癌发生率，A系小鼠出生扣18个月内有90%的肺癌发生率，AK和C57小鼠有高的白血病发生率等等，这些肿瘤多发生于体表部位或易为目前体检新发现的部位。AKR白血病的生长规律研究提示，该鼠出生时即带有致癌的RNA病毒，于鼠龄6～13月内，每月小鼠自发瘤的死亡率为15～20%，而伴有增殖能力的瘤细胞常于诊断前一个月在小鼠胸腺中出现，诊断后中等生存期为16天，以上规律的阐明为化疗提供了基础知识。当前新药研究中自发瘤模型应用最多的小鼠自发乳癌，常用高自发率的C3H小鼠或BALB/C雌鼠与DBA/2雄鼠杂交的第一代CD2F１小鼠（自发乳癌），它们于生后10个半月可摸到肿瘤，而后生存20～35天死亡，大量繁殖此类小鼠，自发瘤可高达70%。一般于摸到肿瘤块后分组给药，观察其平均生存时间的延长率来评价药物的疗效。

路漫漫其修远兮，吾将上下而求索欢迎大家来到普通外科讨论版，本人为活跃版面气氛，开辟“有求必应”子版本，24小时内解答！ http://www.zhihuiyixue.com/bbs/post/page?bid=87&sty=1&age=30

• 【讨论】检验海洋问候各位朋友了

snowy1860

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2008-02-02 23:36

（二）诱发性肿瘤模型

　　用化学致癌物、射线或病毒均可在各类动物中诱发不同类型的肿瘤。强化学致癌物二甲基苯蒽（DMBA）和甲基胆蒽可诱发乳癌，二苯苄芘诱发纤维肉瘤均已列为美国NCI第二筛瘤株。现举DMBA诱发大鼠乳腺癌试验为例，取鼠龄2月的Sprague-Dawley雄鼠，单次灌喂麻油溶解DMBA20mg，肿瘤自60天开始生长，至120天癌发生率达63～100%。此时开始分组给药,并每周测瘤大小及记录死亡时间作为疗效指标。还可用DMBA诱发乳头状瘤，实验用丙酮溶解DMBA150ug/小鼠，隔14天二侧背部皮肤各涂一处，第3周用巴豆油0.5mg，在同一部位每周涂2次共3～4月。当瘤>4mm开始治疗，每天腹注或口服一次，共5次，每周一次共2～6周，用测量瘤大小办法来观察抑制率。用二乙基硝胺（DEN）0.005%掺入饮水中口服8个月诱发大鼠肝癌。此外15PPb黄曲霉素AFB，或0.06%奶油黄连续口服4个月均可诱发大鼠肝癌。于诱发期肿瘤形成之前观察药物的抗致癌作用。用于化疗研究的还有α-萘腰等诱发田鼠和狗的胱膀癌，N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）诱发大鼠胃癌，此外用1%DEN皮下注射，每天50mg/Kg，连续3周再观察半年内小鼠肺癌发生率也可达94%。食管癌和鼻咽癌等也用致癌物诱发成功，部分也已用于药物作用的研究。但致癌的诱癌过程需时较长，成功率多数达不到100%，肿瘤发生的潜伏期个体变异较大，不易同时获得病程或癌块大小较均一的动物供实验治疗之用，再加之肿瘤细胞的形态学特征常是多种多样，且致癌多瘤病毒常诱发多部位肿瘤，故不常用于药物筛选，但从病因学角度分析，它与人体肿瘤较为近似，故此模型常用于特定的深入研究。由于该类型肿瘤生长较慢，瘤细胞增殖比率低，倍增时间长，更类似于人肿瘤细胞动力学特征，常用于综合化疗或肿瘤预防方面的研究。

• 【活动】医考心路

snowy1860

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2008-02-02 23:36

动物肿瘤模型的选择

　　在使用化学致癌致癌时，要注意各类化学致癌剂对动物致癌的特点，如芳香胺及偶氮染料类致癌物的特点是①通常需要长期、大量给药才能致癌；②肿瘤多发生于远隔作用部位的器官如膀胱、肝等；③有明显的种属差异（见表10-9）；④其本身不是直接致癌物，致癌是由于其某种代谢产物的作用；⑤其致癌作用往往受营养或激素的影响，例如，奶黄仅在以缺少蛋白质和核黄素的饲料喂饲大鼠时才引起肝癌，而且雄性大鼠较敏感，邻位氨基偶氮甲苯则易起雌性大鼠的肝癌。

• 【讨论】检验海洋问候各位朋友了

snowy1860

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2008-02-02 23:37

　　（三）移植性肿瘤模型

　　目前肿瘤化疗所应用的大多数药物，都经动物移植性肿瘤试验而被发现，因此它是筛选抗肿瘤新药中最常用的模型。其优点是接种一定量瘤细胞或无细胞滤液（病毒性肿瘤）后，可以使一群动物带有同样的肿瘤，生长速率较一致，个体差异较小，接种存活率近100%。地宿主的影响也类似，易于客观判断疗效，且可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留供试验之用，试验周期一般均较短，因此当前抗癌药筛选中绝大多数用移植瘤试验，如各种体型实肿瘤，腹水瘤和白血病等均被广泛使用。但是这类肿瘤生长速度快，增殖比率高，体积倍增时间短，这些都是与人体肿瘤的显著不同点，特别是与人的实体瘤差别更大。许多国家筛选抗癌药物中选用移植瘤株经常改变，主要原因可能也与此有关。现在世界上保有近500种的动物移植瘤，但常用于筛药的不到40种，多数为小鼠肿瘤，其次是大鼠和仓鼠移植瘤，包括小鼠L1210淋巴白血病，艾氏腹水瘤，Friehd病毒白血病，肉瘤180，Lewis肺癌，腺癌755，白血病615，白血病P388，Walker-256，吉田肉瘤，肉瘤45，Liol淋巴瘤，Dunning 白血病，白血病L5170Y，P1534淋巴白血病，P1798淋巴肉瘤，LPC-1浆细胞瘤，淋巴瘤8，Gardner淋巴肉瘤，B16或Cloadman黑色素瘤，Ridaway骨肉瘤，肉瘤37，P315白血病，Ｗagner癌肉瘤，Mur hy-sturm淋巴肉瘤，Jensen肉瘤，Geurin氏癌，仓鼠十二指肠腺癌和人体肉瘤HSL第1代杂交鼠移植。它们对抗癌药作用的敏感性大致可分为敏感，中度敏感，低敏感和不敏感瘤株四类，敏感瘤株多数生长迅速，瘤细胞增殖比率高，倍增时间短，如L1210、P388、W256，吉田肉瘤，Wagner瘤和肉瘤45。中度敏感的有艾氏腹水瘤和实体瘤，肉瘤180，肉瘤37，格氏癌。低敏感瘤有大鼠肉瘤M1和AkR自发白血病。不敏感肿瘤多生长缓慢，瘤细胞增殖比率低，如小鼠皮肤癌，CH3自发乳腺癌和诱发癌。同样敏感株对抗癌药的疗效水平也不相同。

• 【原创】琴键征

snowy1860

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2008-02-02 23:37

动物肿瘤模型的选择

　　（四）人体肿瘤的异种移植性肿瘤模型

　　将人体肿瘤移植于免疫缺陷动物，因能保持其生物学性，用于研究人体肿瘤对药物的敏感性有较大的帮助，当前日益受到多方面的重视。早期工作是将人体肿瘤移植于动物缺乏免疫防御机能的特殊部位，如鸡胚，动物的眼前房，地鼠颊囊内，虽有一定比例的存活率，但因肿瘤生长缓慢又受植入部位包膜的限制，往往肿块生长较小，难以传代，更不能适应需要较多瘤源的实验治疗工重，近些年来将人体肿瘤移植于免疫缺陷动物或无毛无胸腺小鼠（裸鼠），取得了较大的进展，故美国国立癌症研究所（NCI）于1977年已提出包括人体肿瘤移植于裸鼠的二筛实验模型。人工制造免疫缺陷动物用于异种移植的研究，是先将动物胸腺切除，后给900拉德大剂量照射，照后2小时输注骨髓或再给抗淋巴细胞血清，进行异种移植才能生长。由于异种移植需要附加因子，不同于它们生长在人体的自然条件下，对药物的反应性可能也不同。但由于具有病情类似人体的优点，近年来实验报导日益增多。

　　1966年以来发现和培育了一种无毛裸小鼠突变株，可能直接作为人体肿瘤异种移植的接受体，不需进行附加因子的处理，可使人体肿瘤移植后生长良好。肿瘤细胞形态、染色体含量和同功酶水平与人体肿瘤一样，说明未发生细胞选择和细胞杂交现象，细胞动力学和生物化学特征也未变，故这种小鼠的异种移植人体肿瘤已成为免疫学和肿瘤学研究中较为理想的模型，用于实验治疗方面的研究报导也明显增加。随着对裸鼠生殖生理及生长特点知识积累，目前对如何提高供应量已制订出一套饲养、繁殖和管理办法。目前已成功把将结肠癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、黑色素癌、胃癌、淋巴瘤和白血病、肾病、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于裸鼠，获得一定百分比（37.5%）的良好生长肿瘤部分并可传代。若用已建株的人体肿瘤组织培养细胞作移植材料，接种后成活率更高（41%）。这些成活的肿瘤对化疗药物的敏感性与临床所见十分相近。黑色素瘤以DTIC和CCNU的抑瘤作用较强，而5-Fu则无效，与其临床客观疗效三药分别为20%，12%及2.5%的结果相似。人Burkitt淋巴瘤的祼鼠移植后对环磷酰胺有较高的敏感性，也与临床结果相符，其他肿瘤如乳腺癌和结肠癌裸鼠移植，对前者阿霉素（5-mg/kg）、5-Fu（50～80mg/kg）和苯丙氨酸氮界（7mg/kg）均有一定的抑瘤效能，对后者甲基－CCNU和丝裂霉素也有明显疗效。有趣的是对P388无效的六甲密腰，而对人体肺癌异种移植有效，应用其耐受剂量60～90mg/kg都有消瘤作用，对人体乳癌MX-1和结肠CX-1也有效。此药重新临床试用，证明对人支气管肺癌和淋巴瘤确有治疗作用。最近对过去因毒性较大而中断研究的偶氮氧代正亮氨酸，重新用人肿瘤裸鼠模型评价，证明对MX-1和肺癌XL-1有明显疗效，又重新进入临床研究。近有人用胸腺嘧啶核苷444～888mg/kg给肿瘤裸鼠连续灌注90～140小时，发现它能明显抑制人体黑色素瘤及畸胎瘤的生长，并导致肿瘤消退而对宿主无明显毒性，这些新结果已引起临床重视。

　　近来将人癌组织移植入裸鼠肾囊膜内，观察肿瘤生长大小，在双目显微镜下测量肿瘤直径OMU，比较给药组和对照组的差异，在11天左右可以得到药物疗效的结果。此方法比皮下接种快速，新近用正常小鼠代替裸鼠进行类似试验，在6天或更短的时间内也可获得有价值的资料，因为6天内免疫机能还不可能发挥作用。这样可以节省繁育裸鼠的工作量，有较大的实际意义。

• 【转载】被SCI收录的《中国神经再生研究（英文版）》(Neural Regeneration Research NRR)杂志

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2008-02-04 19:41

谢谢楼主提供，请大家继续留言。

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• 【公告】卫生部关于修订《医师资格考试暂行办法》第三十四条的通知

NCS

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2008-02-10 17:00

支持版主的工作！！

• 【病例讨论】32岁男性，“黑便4~5天，呕血2小时”

NCS

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2008-02-10 17:01

立体化肿瘤转移模型的建立和应用
　　研究生：赵威指导教师：张志谦研究员
　　鸡胚尿囊膜（chick embryo chorioallantoic membrane , CAM）是研究血管发生的重要模型之一，肿瘤的生长与血管生成有密切的关系，抑制肿瘤的血管发生被认为是药物治疗肿瘤的有效、最佳合理手段。利用无免疫活性的鸡胚作为研究载体，观察人体肿瘤在CAM上的生长和转移特征，成为重要的研究模型。因此，CAM即可以作为研究药物作用血管的平台，又可以成为人体肿瘤种植的场所。本研究就利用CAM，种植转移能力不同的成组细胞系，如：乳腺癌细胞BICR-H1和MCF-7；前列腺细胞PC3M-1E8和PC3M-2B4；肺癌细胞PG ，A549和CALU-3，以正常人胚肺细胞RF作为对照研究肿瘤的生长及转移。同时，绿色荧光蛋白（GFP）被广泛应用于肿瘤的转移模型中，时势示踪肿瘤细胞的转移，我们利用带有GFP的腺病毒感染肿瘤细胞，接种于CAM 上，观测肿瘤细胞的浸润、侵袭和转移能力。通过荧光的直接观察，很容易检测到鸡胚血管、肺脏、肝脏的微小转移灶。腺病毒可以直接同时感染增殖性和非增殖性的细胞，方便地解决了体外转染时，克隆亚群的生物变异性，为药物的筛选提供极大的便利。实验设计并建立了pAdEGFP感染5 X 106肿瘤细胞，感染率接近100%，并通过开窗方法接种于10日龄鸡胚尿囊膜上，再过7日后，荧光显微镜观察鸡胚各脏器中的肿瘤细胞。方便，快捷，有效的确立了继发性肿瘤的生长定位和程度，同时也能区分不同肿瘤的转移能力大小。为了验证此方法的效果，我们采取了稳定转染GFP的方法，得到了乳腺癌克隆株BICR-H1-GFP-3（高转移性），和MCF-7-GFP-7（低转移性），比较它们在鸡胚各脏器中的肿瘤大小和转移瘤细胞数。得到的结果相一致。而且，我们利用PCR技术，扩增人非编码区的ALU序列，由于ALU序列只在人体才具有的特殊性，当肿瘤细胞发生脏器转移时，我们可以在鸡胚脏器中得到人的DNA序列，进一步证明某些肿瘤的高转移特征，又为转移做了半定量分析。要进行药物筛选的研究，我们对鸡胚尿囊膜移植瘤模型进行了改进，选增了开第三个方窗的方法，在CAM上采取静脉血管注射药物途径，进行药物模型的建立。真实模拟药物在体内参与循环的作用机制。分别以临床抗肿瘤药物顺铂，及人MMP-2为模板，PCR扩增该基因C末端类血红素样片段PEX，DNA重组技术克隆进PET-28a原核表达载体。转化细菌BL-21，IPTG诱导蛋白表达，Ni-NTA Agarose柱亲和层析纯化融合蛋白PEX进行了相关实验，结果证明顺铂和融合蛋白PEX都可以抑制肿瘤细胞的生长和转移。同时，采用Lewis肺癌C57小鼠模型，选择融合蛋白PEX，比较了动物模型和鸡胚模型的优缺点。为下一步药物筛选提供了有效证据。同时，我们在化学药物的筛选中，对新合成的化学药物Eb及其衍生物近十种药物，利用已建立在肿瘤细胞CAM移植立体模型基础，进行抗肿瘤、转移活性的筛选。从10种不同Eb药物的衍生物中，选择PC3M1E8作为靶点细胞，双盲法进行药物筛选，最终确立了3种不同衍生物的抑制作用。以上实验研究证明鸡胚尿囊膜是有效的肿瘤移植场所，立体化肿瘤转移模型的建立在诸如临床抗肿瘤药物尤其是抗转移药物筛选、肿瘤相关新基因功能筛选以及临床肿瘤新鲜标本生物学恶性行为如转移的评价中具有广阔的应用前景。

• 【病例讨论】32岁男性，“黑便4~5天，呕血2小时”

Blood

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2008-02-19 20:28

小鼠CML模型的构建：
1．  供体细胞来源
方案1：取5-FU预处理后的小鼠骨髓细胞，用带有p210BCR/ABL的复制缺陷型逆转录病毒体转染收集的骨髓细胞。
方案2：直接采用P210BCR/ABL转染的小鼠骨髓细胞系。
2．  细胞移植
1）  将同系基因型的受体小鼠进行照射（普通小鼠11Gy, SCID鼠300Cy）
2）  尾静脉注射5×105细胞/只
3．  CML的鉴定
1）  生存曲线
2）  WBC细胞计数
3）  HE染色：取小鼠外周血和骨髓细胞涂片HE染色，观察其中的粒细胞和淋巴细胞的比例
4）  FACS: 用抗MAC1和抗B220标记细胞，观察粒细胞和淋巴细胞的比例；用抗Gr和抗MAC1标记，观察髓细胞中未成熟细胞（Gr－，MAC1＋）和成熟细胞(Gr＋，MAC1+)的比例
5）  尸解：脾脏的大小和重量，肺部出血情况，同时也可以作成病理切片观察髓细胞的侵润情况

本人采用的时第二种方案，拿转染了p210BCR/ABL的小鼠骨髓祖细胞系32D-BCR/ABL直接从尾静脉注射，小鼠可以时同基因型的C3H或non-scid小鼠，如果不做任何治疗处理，小鼠的生存期为3-4w。周期比较段，如果时方案1的话，小鼠的生存周期大概为2个月。

不自见，不自明，不自矜，不自伐。

• 【分享】头晕浅析

mgl206

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2008-02-20 13:58

SCID鼠肿瘤转移模型和乳腺癌高转移细胞系LM-MCF-7的建立及其应用研究
作者：吴莲英
专业：微生物学
导师：叶丽虹
学位：硕士
单位：南开大学
分类：R730.2　　R737.9
主题：肿瘤转移乳腺癌 SCID鼠动物模型 MLCK 细胞凋亡

内容摘要
该文以人乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象,试图建立一种理想的人肿瘤转移动物模型;进而,在此基础上筛选出高转移倾向的肿瘤细胞系;然后,应用获得的高转移倾向的肿瘤细胞系,探讨肿瘤转移的分子机制.该研究分为以下三个部分:第一,人乳腺癌MCF-7细胞SCID小鼠转移动物模型的建立:采用人乳腺癌细胞株MCF-7细胞悬液,分别接种于5只SCID小鼠腋背部皮下.记录肿瘤生长情况,处死荷瘤鼠并做病理切片,观察各脏器转移情况.结果显示,接种SCID小鼠后6-10天成瘤,成瘤率为5/5只,潜伏期平均7.4±1.3天.分别于接种后第60-68天拉颈处死动物,检测荷瘤,平均直径为26.6±2.2mm,平均重量为5.28g.病理学检查,转移脏器有3个部位,出现肺转移的为4/5只、骨转移的为3/5只和淋巴结转移的为1/5只.第二,高转移倾向乳腺癌细胞系LM-MCF-7的建立及其生物学特征:取肺组织做原代培养,筛选高转移倾向的肿瘤细胞,成功后对该细胞的生长情况、形态学、细胞周期和染色体等生物学特性进行分析研究,并进行特异性抗体检测及SCID小鼠回接再成瘤试验.结果显示:第68天处死的SCID小鼠肺组织原代培养获得成功,建立了高转移倾向的人乳腺癌细胞系,命名为LM-MCF-7,目前已传至80余代.对该细胞系进行生物学特征鉴定的结果显示,形态学上表现为典型的上皮样多角形;流式细胞仪分析显示,DNA相对含量G<,0>/G期为53.40﹪,S期为17.10﹪,G<,2>+M期为23.20﹪;细胞群体平均倍增时间为20.26±14.12小时;染色体分析为人源性异倍体,其数量为16至123条.以此细胞系回接皮下接种SCID小鼠,成瘤率达5/5只,潜伏期平均为5.0±0.0天,30天后处死SCID小鼠,肿瘤直径平均为30.25±2.5mm,瘤平均重量8.47±0.12g.病理学检查转移脏器有6个,肺转移率为4/5只、肝转移率为5/5只、脾转移率为5/5只、肾转移率为4/5只、骨转移率为4/5只和心包膜转移率为1/5只.应用特异性抗体CA15-3进行免疫细胞化学检测,结果各细胞均为阳性,证明LM-MCF-7细胞为人源性乳腺癌细胞.经鉴定,LM-MCF-7细胞与本亲MCF-7细胞相比,成瘤早,转移快,转移部位广泛,是一个新的具有高转移倾向的乳腺癌细胞系.第三,LM-MCF-7细胞系在肿瘤转移研究中的应用:运用建立的高转移倾向乳腺癌细胞系,从二个方面对该细胞株进行了肿瘤细胞转移分子机制的研究 Sad

1)肌球蛋白轻链激酶(MLCK)与肿瘤细胞转移关系的研究;(2)细胞凋亡与肿瘤细胞转移关系的研究.研究结果发现 Sad

1)通过封闭或抑制MLCK激酶区,能比较明显地抑制肿瘤细胞转移,表明MLCK与肿瘤细胞转移存在有密切的关系;(2)高转移倾向乳腺癌细胞的抗凋亡能力增强.该文以SCID小鼠作为肿瘤转移研究对象,建立了理想的动物肿瘤转移模型;在此基础上,建立了高转移倾向乳腺癌细胞系LM-MCF-7,并对该细胞的生物学特征进行了鉴定.进而,应用建立的高转移倾向乳腺癌细胞系LM-MCF-7,初步探讨了MLCK与肿瘤细胞转移的关系和细胞凋亡与肿瘤细胞转移的关系.LM-MCF-7细胞的建立,为今后研究肿瘤细胞转移提供了新的重要工具,如克隆转移相关基因、筛选抗肿瘤转移药物、研制抗肿瘤转移疫苗等,将有助于进一步研究肿瘤转移的分子机理.

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• 【资源】消化系统肿瘤影像诊断

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2008-02-20 14:02

多囊卵巢动物模型构建

摘要】目的根据多囊卵巢形成的机制，建立新的多囊卵巢动物模型。方法给9日龄雌性未成年SD大鼠皮下注射丙酸睾丸酮（1.25mg/只），27日龄再连续9天注射绒毛膜促性腺激素（1.5IU/只）（作为LH的替代物）;观察了卵巢形态、血清激素含量。结果与空白组相比较模型组大鼠卵巢呈现多囊性改变，睾酮（T）升高，LH升高。结论该模型与人多囊卵巢综合征典型改变相近似，其病理生理过程较为吻合，可用于多囊卵巢综合征实验研究。

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是妇科常见的生殖功能障碍性疾病，主要表现为由于卵巢的雄激素过多所造成的闭经、多毛、肥胖及无排卵，其发生占生育年龄妇女的5%～10% 。其发病原因临床尚无定论。建立多囊卵巢综合征动物模型对其病因的基础研究以及指导临床的诊断和治疗有深远的意义。本文提出一种新的PCO动物研究模型建立方法，从形态、内分泌等方面进行了研究，以期能寻找一种理想的PCO病理研究模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物选用孕18～21天的SD大鼠6只，选取所产幼崽24只，9日龄剔除雄性幼崽，21日龄断乳。均由湖南中医学院动物实验中心提供。给予颗粒饲料喂养，自由饮水。饲料由湖南中医学院动物实验中心提供。合格证编号:200310。

1.2 试剂丙酸睾丸酮（天津金耀氨基酸有限公司，生产批号:0304071）;绒毛膜促性腺激素（HCG）（安徽新力药业公司马鞍山分厂公司生产，批号:030409）;放免试剂盒（北京北免东雅生物技术研究所提供）。

1.3 动物模型的建立按参考文献法［2，3］取出生后9日龄SD大鼠24只，模型组和正常对照组各12只，模型组大鼠9日龄颈背部皮下注射丙酸睾丸酮1.25mg/只，27日龄颈背部皮下注射HCG（1.5IU/只），每日2次，连续9天，正常对照组于同期颈背部皮下注射同体积生理盐水。两组分别于36日龄处死。

1.4 取材

1.4.1 血清学检查处死前禁食水8h，称重，用25%的乌拉坦（3ml/kg））麻醉大鼠，颈动脉取血5ml，静置5min，3000r/min离心20min，4℃储存，按放免试剂盒说明书测血清中孕酮、雌二醇、睾酮、促卵泡生成素、促黄体生成素的含量。1.4.2 卵巢形态学观察取出两侧卵巢组织，放入培养皿中，迅速剥离周围脂肪组织，用精密天平称重，放入10%甲醛中固定，送病理室作光镜检查。

1.5 数据处理实验资料为计量资料，以ˉx±s表示，组间差异的比较采用双侧t检验。

2 实验结果

2.1 大鼠体重及血清激素含量见表1。表1 正常组与模型组体重及血清激素含量

2.2 卵巢卵巢大体解剖学改变:卵巢重量:实验组0.0528±0.0127g（n=24），显著高于对照组（0.0283±0.0047g），（P<0.01）;对照组卵巢色泽红，实验组卵巢表面较苍白，体积增大，见较多囊状扩张的卵泡。

2.3 光镜检查正常组（图1，图2）:低倍镜:可见多黄体及不同发育阶段的卵泡，高倍镜下见卵母细胞发育正常，胞核与胞质比例适当，透明带完整，颗粒细胞呈多层（6～10层），形态完整，排列整齐，卵泡膜细胞呈梭形排列（2～3层）。模型对照组（图3、4）:低倍镜:可见多个卵泡囊性扩张及卵泡闭锁，少量卵巢内有黄体组织，高倍镜下见闭锁卵泡内卵母细胞松散、肿胀、胞核固缩。颗粒细胞固缩、坏死，呈深染色团块状，并可见少量中性粒细胞，及见颗粒细胞层次减少，胞膜细胞增厚，卵泡腔内胞浆嗜碱性增强。

3 讨论

PCOS的病理生理是一个复杂的问题，数十年来从不同途径和不同的对象进行逐步深入的探索，结果有相互补充的观点，也有许多争论的问题，已被公认的特征有:（1）雄激素过多;（2）高LH伴有正常或低水平的FSH;（3）恒定的雌激素水平;（4）卵巢组织形态学上有多个囊性卵泡和间质增生;（5）高胰岛素血症和胰岛素抵抗［4］。目前病人依靠药物治疗，所以临床取材非常困难，给病理生理机制的研究带来困难，所以许多学者都在寻找一种理想的病理研究模型来深入研究和探讨多囊卵巢综合征的发生、发展和治疗，多囊卵巢不仅在人，而且在许多种动物都可以发生，如牛、猫、豚鼠、大鼠等［5］。由于大鼠有较稳定的动情周期，对实验研究来说较经济方便。人多囊卵巢的形成是由于卵巢基质过度刺激，高雄激素血症，大量闭锁卵泡引起。故早期研究的病理模型主要是大鼠注射外源性雄激素［6］。亦有使用性激素制作病理模型者，但易自行恢复排卵。雄激素制作病理模型的不足之处是无PCOS表现的卵巢白膜增厚及体积增大，相反其体积和重量只有正常的二分之一，在激素改变方面，血中LH不增加反而减少，对FSH和卵巢楔形切除术不敏感。与人PCOS有很大差别。而其特点是雄激素升高、持续不排卵，并还可导致高胰岛素血症和胰岛素抵抗。由此我们考虑是否可在此基础上根据多囊卵巢综合征除已被公认的特征雄激素过多，还有高LH伴有正常或低水平的FSH、LH/FSH比值倒置，使用雄激素联合绒毛膜促性腺激素（HCG）（作为LH的替代物）制作大鼠多囊卵巢综合征病理模型。因为LH已被证实在排卵前高峰时，促进颗粒细胞的分化，同时还抑制颗粒细胞的有丝分裂，从而限制了颗粒细胞的数量，最终导致卵泡发育停止。多数无排卵PCOS病人中LH是增加的，但没达到其排卵前高峰期水平，此外，胰岛素（INS）与LH也有相关。有实验证实［7］，当对小鼠单独应用HCG（作为LH的替代物），卵巢的大小有轻度的增加，并出现小囊，将INS与HCG联合应用时，卵巢明显增大，并出现多个小囊，与PCOS有相同的卵巢形态变化，阴道涂片检查这些小鼠无排卵。经培养卵泡膜细胞观察INS对雄激素（A和T）生成的影响，INS可增加T和A的基础分泌分别达2倍和3倍，如还有LH存在则T可增加3倍，A可增加6倍。可能LH与INS协调作用促使雄激素生成增加，卵巢增生形成多囊的改变。我们假设INS使LH作用放大，从而进一步增加体内已增加的LH对颗粒细胞的作用，这样LH对正在成熟过程中卵泡的影响相当于在正常周期中仅在LH高峰时所发挥的作用，使颗粒细胞过早进入分化状态，从而导致卵泡的颗粒细胞增殖终止，因此不能发生排卵。我们进行的实验结果表明:使用雄激素联合HCG可造成大鼠卵巢呈现多囊性改变，睾酮（T）升高，LH升高，与人多囊卵巢综合征典型改变相近似，其病理生理过程较为吻合

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2008-02-20 15:37

mgl206 wrote:
SCID鼠肿瘤转移模型和乳腺癌高转移细胞系LM-MCF-7的建立及其应用研究
作者：吴莲英
专业：微生物学
导师：叶丽虹
学位：硕士
单位：南开大学
分类：R730.2　　R737.9
主题：肿瘤转移乳腺癌 SCID鼠动物模型 MLCK 细胞凋亡

内容摘要
该文以人乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象,试图建立一种理想的人肿瘤转移动物模型;进而,在此基础上筛选出高转移倾向的肿瘤细胞系;然后,应用获得的高转移倾向的肿瘤细胞系,探讨肿瘤转移的分子机制.该研究分为以下三个部分:第一,人乳腺癌MCF-7细胞SCID小鼠转移动物模型的建立:采用人乳腺癌细胞株MCF-7细胞悬液,分别接种于5只SCID小鼠腋背部皮下.记录肿瘤生长情况,处死荷瘤鼠并做病理切片,观察各脏器转移情况.结果显示,接种SCID小鼠后6-10天成瘤,成瘤率为5/5只,潜伏期平均7.4±1.3天.分别于接种后第60-68天拉颈处死动物,检测荷瘤,平均直径为26.6±2.2mm,平均重量为5.28g.病理学检查,转移脏器有3个部位,出现肺转移的为4/5只、骨转移的为3/5只和淋巴结转移的为1/5只.第二,高转移倾向乳腺癌细胞系LM-MCF-7的建立及其生物学特征:取肺组织做原代培养,筛选高转移倾向的肿瘤细胞,成功后对该细胞的生长情况、形态学、细胞周期和染色体等生物学特性进行分析研究,并进行特异性抗体检测及SCID小鼠回接再成瘤试验.结果显示:第68天处死的SCID小鼠肺组织原代培养获得成功,建立了高转移倾向的人乳腺癌细胞系,命名为LM-MCF-7,目前已传至80余代.对该细胞系进行生物学特征鉴定的结果显示,形态学上表现为典型的上皮样多角形;流式细胞仪分析显示,DNA相对含量G<,0>/G期为53.40?,S期为17.10?,G<,2>+M期为23.20?;细胞群体平均倍增时间为20.26±14.12小时;染色体分析为人源性异倍体,其数量为16至123条.以此细胞系回接皮下接种SCID小鼠,成瘤率达5/5只,潜伏期平均为5.0±0.0天,30天后处死SCID小鼠,肿瘤直径平均为30.25±2.5mm,瘤平均重量8.47±0.12g.病理学检查转移脏器有6个,肺转移率为4/5只、肝转移率为5/5只、脾转移率为5/5只、肾转移率为4/5只、骨转移率为4/5只和心包膜转移率为1/5只.应用特异性抗体CA15-3进行免疫细胞化学检测,结果各细胞均为阳性,证明LM-MCF-7细胞为人源性乳腺癌细胞.经鉴定,LM-MCF-7细胞与本亲MCF-7细胞相比,成瘤早,转移快,转移部位广泛,是一个新的具有高转移倾向的乳腺癌细胞系.第三,LM-MCF-7细胞系在肿瘤转移研究中的应用:运用建立的高转移倾向乳腺癌细胞系,从二个方面对该细胞株进行了肿瘤细胞转移分子机制的研究1)肌球蛋白轻链激酶(MLCK)与肿瘤细胞转移关系的研究;(2)细胞凋亡与肿瘤细胞转移关系的研究.研究结果发现1)通过封闭或抑制MLCK激酶区,能比较明显地抑制肿瘤细胞转移,表明MLCK与肿瘤细胞转移存在有密切的关系;(2)高转移倾向乳腺癌细胞的抗凋亡能力增强.该文以SCID小鼠作为肿瘤转移研究对象,建立了理想的动物肿瘤转移模型;在此基础上,建立了高转移倾向乳腺癌细胞系LM-MCF-7,并对该细胞的生物学特征进行了鉴定.进而,应用建立的高转移倾向乳腺癌细胞系LM-MCF-7,初步探讨了MLCK与肿瘤细胞转移的关系和细胞凋亡与肿瘤细胞转移的关系.LM-MCF-7细胞的建立,为今后研究肿瘤细胞转移提供了新的重要工具,如克隆转移相关基因、筛选抗肿瘤转移药物、研制抗肿瘤转移疫苗等,将有助于进一步研究肿瘤转移的分子机理.

SCID小鼠转移动物模型的建立中， MCF-7细胞打多少？能否告知。南开叶丽红教师我知道，呵呵。

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2008-03-07 22:58

F1代小鼠L615白血病模型的建立

1 材料与方法
1.1 实验动物: 8~10周龄健康清洁级近交系小鼠:雄性615(H-2k),体重19.5±0.6g(中国医学科学院实验动物所);雌性C57BL/6 (H-2b),体重19.8±0.45g (第一军医大学实验动物中心)。L615 (H-2k)急性淋巴细胞白血病小鼠(中国医学科学院血液病研究所)。
1.2 实验器械及试剂:眼科手术器械, 200目金属网, 5ml针芯,血球计数板, 20μl毛细微量采血管, RPMI1640培养基
1.3 实验方法:
1.3.1 将雌性C57BL/6 (H-2b)小鼠与雄性615 (H-2k)鼠按2∶1比例采用长期同居饲养培育(C57BL/6×615) F1 (H-2kb)小鼠。取发病濒死的L615小鼠,颈椎脱臼处死, 75%酒精浸泡15分钟,超净台内无菌分离脾脏,置于200目金属网上,研磨
同时滴加RPMI1640液,收集细胞悬液并计数。(C57BL/6×615) F1小鼠及615小鼠各分4组(每组8只),分别经腹腔注射接种1×104、1×105、5×105、1×106L615白血病细胞,观察白血病发病情况。取发病濒死(C57BL/6×615) F1小鼠脾脏,同前制备脾细胞悬液,经腹腔注射分别接种1×104、1×105、5×105、1×106个细胞予(C57BL/6×615) F1小鼠(每组5只),观察白血病发病情况。
1.3.2 血象检查:接种后第三天起每天取血检查。小鼠断尾,用20μl毛细微量采血管取血,白细胞计数液稀释20倍,取10μl滴加于血球计数板常规计数;血涂片瑞氏染色找白血病细胞。
1.3.3 病理学检查:取濒死小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、骨髓用10%中性福尔马林固定,冰冻切片,HE染色,光镜检查。

2 结果
(C57BL/6×615) F1小鼠接种L615白血病细胞后100%发病,接种1×104细胞平均生存时间21.94±0.73天、1×105细胞平均生存时间14.69±0.59天,接种5×105细胞平均生存时间13.38±0.79天,接种1×106细胞平均生存时间7.38±0.88天(F=502.627, P=0.000)。615小鼠接种1×104、1×105、5×105、1×106细胞后平均
生存时间分别为22.25±0.60天、14.75±0.71天、12.81±1.22天、7.06±0.42天(F=498.014, P=0.000)。比较接种相同数量(1×104、1×105、5×105、1×106)L615白血病细胞的(C57BL/6×615)F1小鼠与L615小鼠平均生存时间显示无显著差异, t值分别为-1.930、-0.314、2.346、1.667, P值分别为0.095、0.763、0.051、0.140。
请参考林芸,孟凡义,顾为望,"(C57BL/6×615) F1代小鼠L615白血病模型的建立"福建医药杂志2002,24(4期):94-95

L615白血病细胞可以在(C57BL/6×615) F1小鼠体内传代:

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• 【病例讨论】32岁男性，“黑便4~5天，呕血2小时”

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2008-03-24 22:37

可移植性BALB/c小鼠红白血病模型的建立

介绍小鼠红白血病是研究红系造血、红系恶性
疾病较为理想的模型。国外仅有报道的用病毒和用放射线诱发而建立的小鼠红白血病模型。至今,国内外文献中尚未见化学诱发的可移植性小鼠红白
血病模型的报道。中国医学科学院血液学研究所国家重点实验室最先在7,12-二甲基苯蒽(7, 12-dimethylbenzan-thracene, 7, 12-DMBA)诱发BALB/c小鼠白血病实验中发现一只红白血病小鼠,并成功地在同系小鼠中建立了一株可移植性BALB/c小鼠红白血病模型。现将建立过程及其生物学特性报告如下。

材料和方法
1　实验动物　BALB/c小鼠,6~8周龄,体重16~18g,由本所动物室和中国医学科学院实验动物中心提供,均为Ⅱ级。2　7,12-DMBA配制和诱发方法　7,12-DMBA0.5g溶于100ml注射用橄榄油。经口喂服,每只0.2ml(1.0mg),每周1次,连续给药4周。
3　移植实验　无菌条件下取发病小鼠脾脏,制备单细胞悬液,分别进行静脉(眼或尾静脉)、腹腔和皮下接种。经静脉接种白血病小鼠脾细胞2×106/只,常规体
内传代。
4　血象检查　取小鼠尾静脉血,用血细胞计数仪作血常规检测;血涂片行Wright染色,细胞分类计数,网织红细胞于煌焦油蓝染色后计数。
5　血红蛋白和过氧化物酶染色　取发病小鼠尾静脉血涂片,以1%二氨基联苯胺行血红蛋白染色;按Washborn氏法行过氧化物酶染色。
6　细胞免疫化学染色　取发病小鼠骨髓制成单细胞悬液,以抗小鼠Thy-1单抗和抗小鼠Fc受体单抗为一抗,以荧光标记的兔抗小鼠Ig抗体为二抗(均由北京
医科大学免疫系提供),按常规进行免疫荧光检测。
7　染色体检测　用发病明显期小鼠骨髓和脾脏制备细胞悬液,加入0.05μg/ml秋水仙胺,在5%CO2、37℃条件下孵育2小时后收获细胞,0.085mol/L KCl溶液,37℃低渗处理25分钟,制片,Giemsa染色。
8　病理形态学观察　称量发病小鼠体重和肝、脾重量,取骨髓(股骨)、脾、肝、胸腺、肺、心等组织用Bouin液固定,石蜡切片,HE染色,光镜下观察。
9　电镜观察　取发病小鼠脾组织,0.5%戊二醛固定,超薄切片,用H-600电镜观察细胞超微结构变化。
10　无细胞滤液接种试验　制备发病小鼠脾脏无细胞滤液,静脉接种BALB/c小鼠6只,每只0.5ml,观察发病情况。
11　药物敏感试验　静脉接种发病小鼠脾细胞2×106/只,24小时后分组腹腔给药,每天1次,连续6天。
记录发病情况和存活时间,按公式计算抑制率:

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• 【讨论】病例：双肾盂，双输尿管畸形

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2008-03-24 22:42

结　　果

1.模型建立　20只BALB/c小鼠(雌雄各半)口服7,12-DMBA诱发白血病实验中,在停药后第13天(首次给药后第34天),1只雄性小鼠发生红白血病,该小鼠肝、脾明显肿大,胸腺、淋巴结未见肿大,外周血涂片出现大量原始和幼稚红细胞。将该鼠活杀,取脾脏制备成单细胞悬液,给3只同系小鼠静脉接种,结果全部发病;连续传代20代,移植成功率100%,无自发缓解,从而建立了一株化学致癌剂诱发的BALB/c小鼠可移植性红白血病模型(定名EL9611)。

2　动物存活时间　统计5~20代共90只小鼠存活时间,平均为10.2±1.4天,最短9.0天,最长12天,中位数9.5天。不同性别、不同月龄(1.5~5个月)、不同地区(北京和天津)和同一地区不同单位的BALB/c小鼠,其发病及存活时间均无显著性差异。
3　不同途径接种小鼠发病情况:静脉、腹腔、皮下3种途径先后接种BALB/c小鼠102只,发病情况见表1。

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• 【分享】痛性眼肌麻痹

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2008-03-24 22:44

4　接种不同细胞量与小鼠生存时间的关系　静脉接种发病小鼠脾细胞1×(102~106),动物存活时间与接种细胞数呈直线关系(附图)。

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• 【资源】端脑解剖

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2008-03-24 22:46

5　外周血象变化　第15代8只小鼠接种后第9天外周血象:WBC(43.9±17.1)×109/L,RBC (9250±580)×109/L,Ret 0.054±0.004,BPC (309.0±72.8)×109/L, HCT 43%±2%;血涂片有核红细胞约占0.60,其中以早幼和中幼红细胞为主,少数为原始红细胞和晚幼红细胞,并可见病理性核分裂。
6　细胞化学和免疫细胞化学反应　血红蛋白染色,中幼和晚幼红细胞呈黄色阳性反应,原始和早幼红细胞呈弱阳性反应。瘤细胞过氧化物酶染色呈阴性反应;Thy-1单抗、Fc受体单抗染色,瘤细胞均为阴性。
7　染色体变化　共计数了36个染色体分散较好的中期分裂细胞,38和39条者占66.7%,分别含1条和2条双臂染色体,双臂染色体出现率为80.9%。
8　病理形态学和电镜观察　小鼠接种红白血病细胞后,肝、脾逐渐肿大,濒死时肝重为正常的4.6倍,脾重为正常的5.3倍。镜下肝、脾及骨髓有弥漫性白血病细胞浸润,主要为幼稚红细胞,正常组织结构破坏,在骨髓内残留有少量粒系及巨核细胞;淋巴结和胸腺等其他脏器无明显白血病细胞浸润,但脏器血管内有瘤细胞淤滞。脾脏电镜观察,瘤细胞一般呈圆形,表面无明显胞突,胞质内可见较多的线粒体,少量粗面内质网,高尔基体较发达;核呈圆形,可见核仁;并见有核致密的晚幼红细胞;细胞内外未发现病毒样颗粒。
9　无细胞滤液接种试验　发病小鼠脾脏无细胞滤液静脉接种6只同基因小鼠,观察3个月无一发病。
10　药物敏感性试验　EL9611小鼠对3种常用化疗药物的反应敏感性见表2。