【讨论】RNAi 专贴

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【讨论】RNAi 专贴

番茄老人

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2008-02-15 00:11

体外制备
1.化学合成
许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成3?4对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究
不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素
2.体外转录
以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比，还是需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。
最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。
3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法??制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200?1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型
不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗
体内表达
前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。
4. siRNA表达载体
多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究??带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
5. siRNA表达框架
siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中（晶赛公司的Protocol可以解决这一问题）②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）

表siRNA制备方法比较.pdf (51.63k)

番茄老人 edited on 2008-02-15 15:17

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• 【讨论】检验海洋问候各位朋友了

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2008-02-15 00:19

1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫（C. elegans）中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。
直到1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference ,简称RNAi）。
在随后的短短一年中，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。
体外实验表明：RNAi反应中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。从已经发生RNAi的果蝇S2细胞中，Hammond等人部分纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不该呢？由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出21-23核苷酸长的 dsRNA 片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果，人们提出一种RNAi作用的简单模型。当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸酶的dsRNA结合结构域结合，并且作为模板识别目的mRNA；识别之后，mRNA与dsRNA的有义链发生链互换，原先dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位置。核酸酶在同样位置对mRNA进行切割，这样又产生了21-23核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现象。通过遗传分析的方法，目前已从线虫中已分离到RDE-2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。

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• 【试题】护师资格考试试题

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2008-02-15 00:21

RNAi的作用机制RNAi作用机制图解（以线虫中的三种不同形式为例）

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• 【进展】2008呼吸科进展（最新的呼吸科指导文献）

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• 【资源】阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征专家共识（2007年草案）

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2008-02-15 00:26

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• 【转载】支持尽快修改现行《中华人民共和国执业医师法》的来签名

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2008-02-15 00:28

miRNA和siRNA的基本介绍及区别
1998年，Andrew Fire和Craig Mello提出了一项新技术：通过dsRNA诱导特异基因的
沉默，即所谓RNAi。2000年，Amy Pasquinelli等将lin-4和let-7作小时序RNAs(stRNAs
，mall temporal RNAs)。
RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA
）诱导序列特异的目标基因的沉寂，迅速阻断基因活性。SiRNA在RNA沉寂通道中起中
心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。siRNA是RNAi途径中的中间
产物，是RNAi发挥效应所必需的因子。SiRNA的形成主要由Dicer和Rde-1调控完成。
由于RNA 病毒入侵、转座子转录、基因组中反向重复序列转录等原因,细胞中出现了
dsRNA，Rde-1(RNAi缺陷基因-1)编码的蛋白质识别外源dsRNA，当dsRNA达到一定量的
时候，Rde-1引导dsRNA与Rde-1编码的Dicer（Dicer是一种RNaseIII 活性核酸内切酶
，具有四个结构域：Argonaute家族的PAZ结构域，III型RNA酶活性区域，dsRNA结合
区域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性区）结合，形成酶-dsRNA复合体。在Dicer酶的作
用下，细胞中的单链靶mRNA（与dsRNA具有同源序列）与dsRNA的正义链互换，原来dsRNA
中的正义链被mRNA代替而从酶-dsRNA复合物中释放出来，然后，在ATP的参与下，细
胞中存在的一种RNA诱导的沉默复合体RNA-induced silencing complex （RISC，由
核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等构成，作用是对靶mRNA进行识别和切割）利用结
合在其上的核酸内切酶的活性来切割dsRNA上处于原来正义链位置的靶mRNA分子中与
dsRNA反义链互补的区域，形成21-23nt的dsRNA小片段，这些小片段即为siRNA。RNAi
干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。SiRNA并入RISC中，
然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对，降解靶标基因，因此说siRNA只降解与其序
列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以
是一种典型的负调控机制。siRNA识别靶序列是有高度特异性的，因为降解首先在相
对于siRNA来说的中央位置发生，所以这些中央的碱基位点就显得极为重要，一旦发
生错配就会严重抑制RNAi的效应，相对而言，3′末端的核苷酸序列并不要求与靶mRNA
完全匹配。
MicroRNA（miRNA,微RNA）即为长度为22nt左右的5′端带磷酸基团、3′端带羟基的
非蛋白编码的调控小RNA家族。miRNA广泛存在于真核生物中，不具有开放阅读框架，
不编码蛋白质，一般长20-24nt，miRNA的转录产物是发夹状结构，在RNaseⅢ酶切后
以双链形式存在，最后释放互补链，miRNA成熟。成熟的miRNA 5′端的磷酸基团和3
′端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。miRNA的又一特点??基
因表达时序性。MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织
和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。miRNA
可能的形成及作用机制为：先由长的内源性转录本（pri-miRNA）生成70nt左右的miRNA
前体（pre-miRNA），然后在Dicer酶的作用下使其加工成为一个不稳定的dsRNA分子
，接着迅速被降解剪切为22nt左右的单链RNA（这种单链RNA及以后的miRNA只是Dicer
作用下pre-miRNA被剪切的一个臂，可能是3′端的一个臂，也可能是5′端的一个臂
，不同RNA可能是同一pre-miRNA的不同臂），之后被PPD(PAZ&Piwi domain)蛋白家族
识别，形成RNA-蛋白质复合体即miRNA核蛋白体（miRNP）,进而形成成熟的miRNA。miRNA
识别并与靶标基因3′UTR区部分配对，从而抑制靶标基因的翻译。miRNA基因是一类
高度保守的基因家族，按其作用模式不同可分为三种：第一种以线虫lin-4为代表，
作用时与靶标基因不完全互补结合，进而阻遏翻译而不影响mRNA的稳定性，这种miRNA
是目前发现最多的种类。第二种以拟南芥miR-171为代表，作用时与靶标基因完全互
补结合，作用方式和功能与siRNA非常类似，最后切割靶mRNA,这说明某些miRNA和siRNA
一样参与了机体内一些特异性mRNA的剪切过程。第三种以let-7为代表，它具有以上
两种作用模式。
miRNA对生长发育进行更为重要的调控作用。同时，科学家们也发现人类基因组中大
约有255个编码miRNA基因，约占人类基因数的1%，但尚不清楚其功能。最近科学家发
现小RNA 与‘epigenetic’现象有联系。所谓epigenetic 是指并不涉及遗传序列的
特征性的遗传改变。有人已试图将小RNA 用于抗病毒治疗之用,认为它们有可能抑制
HIV21 和灰质类病毒丙型肝炎病毒的转录,以及也可能用于肿瘤的治疗。
miRNA与siRNA之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在22nt左右。2.二者都依赖Dicer
酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。3.二者生成都需要Argonaute
家族蛋白存在。4.二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉
默机制上有重叠。5.miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的。
miRNA与siRNA的不同点：1.根本区别是miRNA是内源的，是生物体的固有因素；而siRNA
是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。2.结构上，miRNA
是单链RNA，而siRNA是双链RNA。3.Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称
加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于
双链RNA的前体的两侧臂。4.在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，
而siRNA可作用于mRNA的任何部位。5.在作用方式上，miRNA可抑制靶标基因的翻译，
也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，而siRNA只能导致靶
标基因的降解，即为转录水平后调控。6.miRNA主要在发育过程中起作用，调节内源
基因表达，而siRNA不参与生物生长，是RNAi的产物，原始作用是抑制转座子活性和
病毒感染。

番茄老人 edited on 2008-02-15 00:31

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• 北京朝阳妇幼医院招聘。

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2008-02-16 00:38

真是不错啊，看了对RNA干扰的知识大有长进了。呵呵。

• 【讨论】经纤维支气管镜针吸活检述TBNA论坛

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2008-02-17 16:08

晶美的RNAi讲座

RNAi（中文）.pdf (1818.8k)

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• 北京朝阳妇幼医院招聘。

franca2008

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2008-02-25 22:07

郭苏好像是复旦的，真是可惜了，在北京上课的时候，老师还专门说过他的那篇cell文章

• 【资源】孙建方教授-带状疱疹资料

Blood

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2008-02-28 13:10

RNA干扰常见问题与解答

1.RNA干扰各种方法的优缺点如何？

答：各种常用方法的优缺点如下：
(1)化学合成dsRNA：优点：快捷，通常6－8天内就可以从供应商处拿到定制的RNA oligo。
(2)体外转录dsRNA：优点：价格相对低廉。缺点：操作困难、耗时。
(3)PCR制备编码shRNA的转录DNAs：优点：经济，较快捷。缺点：这种dsDNA导入细胞有一定难度。
(4)shRNA表达质粒：优点：基因干扰效果持久，经济；缺点：制备耗时；导入效率较低下；还涉及质粒在细胞内的定位、shRNA体内折叠效率，非特异性基因抑制等。

2:siRNA设计的时候应该注意什么？

　答：siRNA设计是一个需要由软件完成的工作，但其中也有一般规律可寻： 1.起始密码子75-100个以后，终止密码子100个以前的片断 2.GC比例在35-50之间，最好不要超过55% 3.设计好的序列必须进行blast同源分析。需要提醒的是，对于任一个靶基因，RNAi的选择都带有一定的随机性。

3.应该使用什么溶剂溶解RNA，水还是缓冲液？
推荐使用1xTE缓冲液（在无RNase的条件下配制 10 mM TrisCl, pH7.5, 0.1 mM EDTA）溶解单链RNA，这将缓冲pH和鳌合金属离子，减少RNA的降解。也可以使用无RNase水，双链的RNA冻干自10 mM Tris-HCL, pH 8.0, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA，再次悬浮在适量的水中，RNA浓度到20μm，将恢复到相同的缓冲液。

4.如何在RNA oligo的OD、 nmol和质量间进行换算的？

　答：RNA oligo的OD、 nmol和质量间有精确的公式可以计算，但一般情况下，对于一个21 bp 的siRNA oligo，有如下简单关系：1 OD duplex＝3 nmols＝40ug
5.现在RNA干扰的产品很多，应该如何选择RNA干扰产品？

　答：现在市场上销售的RNA干扰产品虽然很多，但大体可以分为两类，一类是化学合成的RNA oligo；另一类是依托于分子生物学操作的试剂盒。这两类产品目前都广泛用于RNA干扰研究。作为刚刚进入RNA干扰研究的用户，比较好的研究路线是先针对你要研究的基因，合成一个由4～5对RNA oligo组成的一个RNA oligo 组，用这组RNA oligo筛选出具有明确基因下调作用的特定RNA oligo。下一步，可以根据您的研究需要，选择使用载体或者使用合成相对大量的RNA oligo。一般情况下，如果后继研究希望通过观察基因持续下调研究基因功能，你需要选择稳定表达的载体系统；如果后继研究希望观察一个RNA 干扰片段作为药物的作用和作用结果，就需要合成较大量的RNA oligo。

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• 【讨论】08年执考分数线之猜想篇

Blood

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2008-02-28 13:12

RNAi 相关术语：

* Dicer - Dicer is a member of the RNase III family of nucleases that specifically cleave double-stranded RNAs. Dicer processes long dsRNA into siRNA of 21-23 nt.

* Interferon - A small and highly potent molecule that functions in an autocrine and paracrine manner, and that induces cells to resist viral replication. This term is related to because in mammals introduction of dsRNA longer than 30 nt induces a sequence-nonspecific interferon response.

* Micro-RNA - Micro-RNAs (miRNA) are single-stranded RNAs of 22-nt that are processed from ~70-nt hairpin RNA precursors by Rnase III nuclease Dicer. Similar to siRNAs, miRNAs can silence gene activity via destruction of homologous mRNA in plants or blocking its translation in plants and animals.

* Post-Transcriptional Gene Silencing - Post-transcriptional gene silencing (PTGS) is a sequence-specific RNA degradation system designed to act as an anti-viral defense mechanism. A form of PTGS triggered by transgenic DNA, called co-suppression, was initially described in plants and a related phenomenon, termed quelling, was later observed in the filamentous fungus Neurospora crassa

* Ribozyme - Ribozymes are RNA molecules that act as enzymes in the absence of proteins.

* RNA Interference - RNA Interference (), a term coined by Fire et al in 1998, is a phenomenon that small double-stranded RNA (referred as small interference RNA or siRNA) can induce efficient sequence-specific silence of gene expression.

* RNA-Directed DNA Methylation - RNA-directed DNA methylation (RdDM) is an RNA directed silencing mechanism found in plants. Similar to RNA interference (), RdDM requires a double-strand RNA that is cut into short 21-26-nt fragments. DNA sequences homologous to these short RNAs are then methylated and silenced.

* RNA-Induced Silencing Complex - RNA-induced silencing complex (RISC) is an siRNA-directed endonuclease, catalyzing cleavage of a single phosphodiester bond on the RNA target.

* Trigger - triggers are double-stranded RNAs containing 21-23 nt sense and antisens strands hybridized to have 2 nt overhangs at both 3' ends.

* Small Interfering RNA - Small Interfering RNA (siRNA) is 21-23-nt double-strand RNA. It guides the cleavage and degradation of its cognate RNA.

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• 【公告】2009年医师资格考试的新大纲

jack99

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2008-02-29 21:11

1. siRNA 设计原则

1.siRNA双链末端的热稳定性，即的值

2.siRNA双链的反义链末端最后两个碱基的选择，即：20，21位置碱基的选择

3.siRNA双链的反义链第1和第19位置的碱基的选择

4.siRNA反义链的G+C的含量

5.siRNA反义链的第2位和第18位置的碱基的选择

6.siRNA反义链的第2位到17位局部稳定性的选择

7.siRNA双链的正义链为基准，整个双链稳定性的分布为，5’末端稳定性强，双链中间段，以断裂位点周围为例，稳定性较弱，3’段稳定性较弱

Sense:
5’ NNNNNNNNNNNNNNNNNNN TT 3’

antisense:
3’ NN NNNNNNNNNNNNNNNNNNN 5’

mRNA:
5’ dNdN NNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3’

注：正义链sense: 19碱基的靶点+TT悬头

反义链antisense:21个碱基完全与靶点互补

反义链最后两个碱基为脱氧核酸dNdN

2.shRNA设计原则

shRNA设计原则与siRNA设计原则相比有其特殊性。源于shRNA的siRNA相对于外源导入的siRNA在细胞内的有效浓度要低。shRNA末端设计以及双链的热稳定性是以DNA设计为基础，而siRNA是以mRNA为基础。

1．从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。

2．避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。

3． siRNA序列的GC含量应为30%-60%左右。

4．在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

5．将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。

6．将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。由于没有完整的基因组序列，比对起来相对困难。

7．选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

8．阴性对照:一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样需要检查它和其他基因是否具有同源性。

介绍几个设计rna干扰片段的网站：
武汉晶赛：
http://www.genesil.com/siRNAdesign.asp
ambion公司：很多文献都是在这个网站设计的
http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html

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