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| 【讨论】基因治疗专题 |
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番茄老人
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 2008-02-14 23:11      
番茄老人 edited on 2008-02-15 20:33
天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 【讨论】检验海洋问候各位朋友了 |
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2008-02-14 23:12 一些常见疾病的治疗策略见表1。 表1 基因治疗策略 遗传性疾病 --隐性遗传病 --用正常基因置换致病基因而达到完全校正 --导入正常基因序列以达到暂时性校正 --显性遗传病 --用正常基因置换致病基因而达到完全校正 --使有害基因失活而达到暂时性校正（如用反义技术、核酶等） --在某些情况下可导入正常基因加以校正（如LDL受体） 肿瘤 --杀伤肿瘤细胞（如利用自杀基因，激活免疫系统及保护正常细胞免受化疗药物的损伤等） --使癌基因失活（反义技术、核酶）或增加抑癌基因的表达 传染病 --杀伤传染源（免疫法、自杀基因） --使传染源失活（反义技术、核酶、核酸陷井） 其它疾病 --导入药物基因（药物释放）如激素、细胞因子 --失活有害基因产物（反义技术、核酶、核酸陷井） --杀伤策略如减少特异细胞群 天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 【资源】检验与护理 |
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2008-02-14 23:13 二、基因治疗的基本程序 基因治疗是在基因工程基础上发展起来的分子生物学技术，它相对于现有其它治疗方法较为复杂。基因治疗的基本过程包括以下主要方面： （一）目的基因的选择和制备 基因治疗的首要问题是选择用于治疗疾病的目的基因。对遗传病而言只要已经研究清楚某种疾病的发生是由于某个基因的异常所引起的，其野生型基因就可被用于基因治疗，如用ADA基因治疗ADA缺陷病。但在现在的条件下，仅此是不够的。可用于基因治疗的基因需满足以下几点：在体内仅有少量的表达就可显著改善症状；该基因的过高表达不会对机体造成危害。很显然某些激素类基因如与血糖浓度相关的胰岛素基因目前尚不能用于糖尿病的基因治疗。在抗病毒和病原体的基因治疗中。所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史和起重要的作用并且该序列是特异的，如针对HBV的HBeAg或X基因等。肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因转入人体，肿瘤细胞内往往存在多种基因异常形式，可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因或向细胞内转入野生型抑癌基因，抑制肿瘤生簪，所针对的癌基因或抑癌基因应下该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。 在确定欲选目的基因后，就在制备目的基因。正向表达的基因可以是cDNA（complementary DNA），也可是基因组DNA(genomic DNA)片段。可用传统的方法获取，也可采用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction PCR)等新技术进行体外扩增。部分反义基因也可采用此法获得，但多数情况下采用人工合成的方式制备。 （二）基因的转运 目前已有多种基因转运的方式，其基本原则是将外源基因运到细胞内。已使用的有病毒载体和非病毒载体两大类。 病毒载体：病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RNA病毒能整合到染色体以及基因水平较高等。因此病毒载体是良好的基因转运载体。目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的病毒。疱疹病毒和肝炎病毒等。逆转录病毒用作载体时需进行几步改造：（1）将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因，如图1所示。（2）制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能，如图2所示。（3）将载体DNA导入辅助以产生病毒载体。如图3。（4）病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达 天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 【资源】公卫中级考试 |
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2008-02-14 23:17 STEP 1 INSERTING FOREIGN DNA INTO THE RETROVIRAL PROVIRUS Wild-Type Provirus 图1 Scientists use recombinant DNA techniques to replace the gag,pol,and env genes with one or more foreign genes.The foreign genes can be inserted in several different patterns.in this example,a selectable marker gene(neo)replaces the viral gag and pol genes and a human gene replaces the env gene. 
天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 2009年元旦快乐 |
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2008-02-14 23:18 STEP 2 MAKING THE HELPER CELL Desiging the Helper Vius 图2 The helper cell should meet two basic requirements  1)it should provide functions missing from the the vector virus,and(2)it should not be capable of producing viable virus particles. The crucial element in the development of a successful helper cell is the design of the helper virus. Researchers use recombinant DNA techniques to disable the helper virus in the test tube-one of the most common measures is removal of the Psi fragment. The Psi-deficient helper virus produces all of the normal viral proteins, but cannot package its own RNA because it lacks the appropriate packaging signal. Helper virus DNA is inserted into the genome of the helper cell using chemical techniques.
天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 【讨论】报名护士考试网络视频辅导的园友进 |
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2008-02-14 23:19 STEP 3 PRODUCING THE VECTOR 图3 Scientists use chemical measures or an infection technique to insert recombinant vector DNA (including a human gene) into helper cells. Because the vector provirus contains the Psi sequence, the vector RNA genome is automatically encapsulated by viral proteins produced by helper virus DNA in the helper cell. The resulting viral particles are released by budding from the helper cell membrane. The vector virus is capable of only one infection because it lacks the information needed to 
天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 【共享】心血管核医学（cardiovascular nuclear medicine） |
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2008-02-14 23:21 STEP 4 INFECTING THE TARGET ELL 图4 Researchers infect target cells (such as human bone marrow cells) with the vector virus in two different ways: they mix them with helper cells producing the virus, or they bathe them in fluid harvested from the helper cell culture. When the vector provirus is integrated into the target cell DNA ,enzymes from the target cell treat it as an integral part of the genome. Cellular enzymes do the work necessary to make proteins from the foreign genes located between the two viral L TRs. 
天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 【讨论】08年执考分数线之猜想篇 |
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2008-02-14 23:25 非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是脂质体，一些具有受体功能的载体也呈现出诱人的前景，关于常见载体的优缺点列于下表。（清晰见链接PDF）  常见载体的优缺点.pdf (57.37k)
番茄老人 edited on 2008-02-14 23:55
天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 【讨论】反复胸闷、气短10个月余,加重伴不能平卧4个月 |
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2008-02-15 00:01 （三）靶细胞的选择 理论上讲，无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，而只能使用体细胞，用于转基因的体细胞必须取材方便，含量丰富，容易培养，寿命较长。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。在实际上应用中应具体根据目的条件选择。 （四）细胞转染（tansfection） 将目的基因导入靶细胞的方法很多，大致可分为物理学方法、化学方法、融合法和病毒感染法四类。病毒法已在本节的“基因的转运”中有基因介绍。目前较多使用的是脂质体法。 在目前的技术状态下，一般而言其基因转染效率很难达到100%。故必须首先将转导细胞和未转导细胞加以区分。这方面的新技术发展很快，常用的转导细胞筛选方法有： 利用基因表达产物筛选法：（1）标记基因筛选法：在载体上引入一个标记基因，或同时导入标记基因，在转染后的适当时间选用合适剂量的选择培养基，筛选标记基因表型，那些已导入外源基因的细胞将存活下来，而未转录的细胞则死于选择性细胞培养基。如在较多的载体中都有neor标记基因存在，若向培养基中加入G418进行选择，最后只有转导细胞存活下来。（2）基因缺陷型受体细胞的选择性：以基因缺陷型细胞作为靶细胞，将正常基因导入基因缺陷型靶细胞后，使用选择性培养基进行筛选。例如将TK基因导入TK-的靶细胞，转录细胞可在HAT培养基中生长，未转导的细胞则不能在HAT培养基中生长。（3）基因共转染技术：将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载体DNA混合后共同转移到靶细胞中，分别使用标记基因和目的基因对应的选择剂进行两次筛选，最后得到复合转导的转化子。 分子生物学方法：外源基因是否真的转入靶细胞必须用分子杂交方法进行证实。常用的方法有原位杂效，Southern杂交和打点杂交。其中主要问题是探针的选择。若靶细胞内原来不存在所转入的目的基因，可选用目的基因作为探针；靶细胞内一般无标记基因存在，故标记基因是良好的探针。探针大小可以是较大的DNA片段，亦可是人工合成的DNA单链探针分子。PCR方法目前也已用于转导细胞的鉴定，且该法相对简单易行。 表3 DNA导入哺乳动物细胞常见的方法： 表3 DNA导入哺乳动物细胞常见的方法.pdf (56.43k)
天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 【原创】全国共享治疗疼痛及妇科炎症的最新技术 |
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2008-02-15 00:04 （五）外源基因的表达及检测 在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，Northrn杂交，NRA打点杂交，免疫组织化学染色等，前几项是检测外源基因转录出的mRNA，后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。流式细胞仪是一种较为客观准确的仪器，可定量分析外源基因的表达状况。 表4 调节重组细胞表达系统的DNA控制元件 启动子 病毒启动子：如LTRS，CMV，SV40启动子在短时间后易于关闭，尤其是在逆转录病毒中 看家基因启动子：如二氢叶酸还原启动子可长期表达转基因，但水平很低。 组织/细胞特异性启动子：一些编码含量丰富蛋白的基因的启动子如肌肉中肌酸激酶的启动子能够进行特异性强表达 可诱导启动子：如金属硫蛋白基因的启动子，类固醇诱导的启动子可调节基因表达 其它调节转录的顺式作用调节元件 增强子，位点控制元件，内含子序列及编码序列本身可影响基因表达调节。 影响转录后表达的序列 3’-mRNA序列：对于稳定mRNA及进行翻译可能是必需的 三、基因治病的靶向 基因治疗中的靶向问题是基因治疗中急待解决的问题。逆转录病毒载体是目前治疗中应用较为广泛且效果较好的载体。有关逆转录病毒靶向的研究已取得一些进展，使得基因治疗更为安全和有效。 天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 【讨论】病例：双肾盂，双输尿管畸形 |
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2008-02-15 00:05 （一）逆转录病毒转导的细胞类型的选择调节 Mo-HLV是一个可广泛转导多种细胞的病毒，为了使其仅感染某些专一性细胞就必须改变其感染谱。 1、改变Mo-HLV感染谱 按宿主范围可将Mo-HLV分为三类：单向性：只能感染啮齿类细胞；异向性：可感染除啮齿类动物细胞以外的其它的细胞；双向性：可感染人及啮齿类动物等大多数细胞。感染细胞的类型是由病毒的外壳蛋白env确定的。 （1）病毒与抗体的偶联：为了使逆转录病毒定向感染所需要的靶细胞，可将病毒与抗体偶联，该抗体则针对所需感染细胞上特有的抗原。如使单向感染病毒与抗人MHC-1。MHC-II的抗体偶联或与抗人表皮生长因子的抗体偶联后，可以感染人类细胞。Goud等使用此法使单向病毒感染人的肝细胞，可惜病毒未能整合入肝细胞基因组，可能其中还有其它原因。 （2）病毒外壳蛋白与配体偶联： 如将env蛋白与乳糖偶联成去延酸糖蛋白，用此法改造的单向逆转录病毒将不再感染原先的宿主而只感染人的肝细胞，因为只有肝细胞表面上含有去延酸糖蛋白的受体。 （3）改变病毒外壳蛋白的识别序列：已发现env蛋白与被感染细胞受体相识别部位的化学组成，如果改变核表位的基因序列，就可能改变感染细胞的类型，但Etienne等认为有一个潜在的、非病毒原有的表位与细胞受体识别之后不能使病毒内化。一种可行的方法是同时表达原有的env蛋白，就能解决内化问题。 2、使用其它逆转录病毒载体： 牛白血病逆转录病毒，猿免疫缺陷病毒，鼠乳腺肿瘤病毒有组织专一性感染的特点，有些研究组利用其作为载体。Page等采用HIV作为病毒载体，Rizvi等用BLV作载体，Morris等采用MMTV作载体，并构建了MMTV独特的包装细胞，使病毒滴度提高百倍以上，但同Mo-MLV相比，其它病毒的滴度偏低。 3、以嵌合逆转录病毒为载体 逆转录病毒感染谱是由病毒颗粒决定的，如果我们改变病毒颗粒蛋白，即保留毒gagpol基因，而env基因来自另一个逆转录病毒，即可改变感染宿主范围。Laudau等用鸟逆转录病毒和RSV的env基因取代 Mo-MLVR env基因，Miller等用长臂猿白血病病毒的env基因嵌合 Mo-MLVR成功感染了多种细胞，并取得较高的滴度，Gong等用流感病毒的血凝素取代RSV的env基因蛋白，将血凝素成功地嵌入病毒外壳，并能有效感染人和鸟类细胞。Jane等用泡状口炎病毒G糖蛋白取代莫洛尼病毒env蛋白，使该病毒颗粒能成功地感染非哺乳动物如Zebra fish细胞，更重要的是这种病毒外壳可耐受超离心而不影响感染效率，因此有利于浓缩病毒，提高滴度。 天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 【公告】2009年医师资格考试的新大纲 |
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2008-02-15 00:05 （二）目的基因组织专一性表达的调节 许多组织专一性表达的调节片段已研究清楚，把这些片段与目的基因一起重组入逆转录病毒可用于基因的靶向表达。 1、肝专一性表达 肝专一性表达研究较多的是磷酸烯醇式酮酸羧激酶的启动子。McGrane 等用了转基因动物技术使该启动子表达外源基因，证明该启动子专一性地在肝和肾等中表达；Hatzoglau等用PEPCK启动子与neo基因或牛生长因子重组入逆转录病毒载体。克隆后经腹腔注射入子宫感染鼠胎肝或注入门静脉并切除部分肝，证实前病毒可整合肝细胞基因组，并持续表达了八个月之久，而且牛生长因子表达量受食物刺激信号的调节。 另一个肝专一性表达的片段是A-胰蛋白酶基因的顺式作用因子。Simon等的研究表明，α-AT基因上游是决定肝专一性表达的片段，（-137～37）为最短的肝专一性表达的片段。Peng等用α-AT的（-730-30）片段与SV40启动子融合驱动人苯丙氨酸羟化酶基因，使其在肝脏专一性表达，为苯丙酮尿症基因治疗奠定了基础。 α-FP为肝癌细胞特有的高效表达产物，Watanabe等发现其上游调控区（-3700～3300）决定了α-FP在肝癌中的专一性表达。Huber等将片段与你腺嘧啶激酶基因融合，克隆入逆转录病毒后转染肝细胞，然后给予无毒性原药-阿拉伯糖核苷，只有肝癌细胞才专一性地合成TK，批ara-MF转化成细胞毒性ara-ATP，造成肝癌细胞的死亡，而其它感染了α-EF-TK的细胞不受影响。 2、肌肉专一性表达 肌肉中高效表达的是肌苷激酶的调控片段。Johnson等发现MCK调控区有两个增强子：一个位于（-1256～1049），决定肌肉和心肌专一性表达，另一个位于第一内含子（738～1599），只决定在心肌的高效专一性表达。Cox等用这两个增强子使Dystrophin在肌肉的表达量增强50倍，完全纠正了mdr鼠肌肉病理变化，而且无付作用，最近，Yao等用2分MCK增强子（-1350～1048）使人凝血因子IX在肌母细胞中得到高效表达。 3、乳腺专一性表达 在乳腺中专一性表达的基因有β酪蛋白，乳清酸蛋白，鼠乳腺肿瘤病毒，三都调控区中的负调控片段决定他们仅在乳腺组织中表达。 4、黑色素瘤专一性表达 黑色素瘤特异性表达酪氨酸和酪氨酸相关蛋白。决定酪氨酸专一性表达的片段是在该基因上游（-270～1），决定TRP-1专一性表达的区域为（-640～165），Hart等用上述调控区与Gal报告基因融合，在人与鼠的黑色素瘤细胞中均检测到其表达。 5、胶质瘤专一性表达 目前已知鞘磷酸碱性蛋白基因上游（-1300～1）片段决定其在胶质瘤细胞中的专一性表达，Miyao等用该片段与HTK基因融合，转染胶质瘤细胞，在1μMganciclovir培养液中，90%胶质瘤细胞死亡，而对照组生长不受影响。 6、肺癌专一性表达 人表面活性蛋白A是大多数肺癌表达的物质。Smith 等用SPA-1上游（-2600～178）片段驱动HSV-TK基因，转化肺癌细胞株H441 ，给予ganciclovir后，H441大量死亡。 天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 【资源】EndNote.X2中文说明 |
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2008-03-16 19:05 基因治疗的相关术语 体外转基因： 把遗传物质转至寄主外部的细胞。经遗传物质移植后的细胞再回到寄主中。这个术语还被称为转基因的非直接方法。 体内转基因 ： 遗传物质转入寄主体内的细胞。这还被称为转基因的直接方法。 基因治疗： 把选择过的基因转入具有改善或治愈疾病希望的寄主中。 细胞治疗（基因组治疗）： 把未经遗传性修正的完整的细胞转入寄主中，使被转移的细胞将产生促进与寄主结合并改善寄主功能的希望。 体细胞转化： 把基因转入非种系组织中，它具有校正病人疾病状态的希望。 种系基因： 把基因转入种系组织中（蛋或胚胎），它有希望改变下一代的基因组。 转基因： 在转基因实验中，选择试验基因。例如，如果你给患苯并酮尿症病人治病，你可计划把一校正过的苯丙氨酸羟基酶基因译本移入肝细胞中。在这个例子中，苯丙氨酸羟基酶的校正译本就是转基因。 报告基因： 常用于试验基因转换效率的基因。例子是luceriferase, --半乳糖和氯氨素乙烯转化酶。 基因转化载体： 基因被转移进细胞的机理。 转化率： 正在表达所期望的转基因百分率。 天行键，君子以自强不息 地势坤，君子以厚德载物 • 【资源】公卫中级考试 |
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2008-03-17 21:54 基因治疗的实验方法 虽然对作为疾病治疗手段的基因治疗充满巨大的希望，但开发高效临床方案的进展仍然缓慢。问题在于安全和有效的基因输送系统的开发。本章将评估这一新医疗领域的问题和潜在的答案。 人类基因治疗的第一个认可的临床试验报告始于1990年9月。自此以后的七年半时间里，世界上，已认可了300份临床试验报告，超过3000个病人体内已进行了遗传工程化细胞的治疗。从这些试验中得出的结论是：基因治疗对治疗人类多种疾病有潜在的优势，并产生很低的副作用，然而在解决病人疾病方面，其效率仍失望地低。除了不是根据对照临床试验报告的个别病人得到帮助外，仍没有论据证明基因治疗试验在人类疾病的治疗上已经成功。为什么这样说？ 本章将通过评估原先设想及基因治疗的问题来考察“为什么这样说？”根据把基因输送到受影响组织模式的不同，有体细胞基因治疗的不同方式。其挑战是把基因治疗作为一种有效和安全的药物输送系统去开发。该目标比五年前许多研究人员曾期待获得的更困难。人体花费了几千年时间学到了如何保护自己免遭外来环境的侵犯，包括把外来DNA结合到自身的基因组中去。然而，病毒在克服这些障屏并能把自身的遗传物质嵌入人体细胞方面只获得了部分成功。因此，在基因治疗方面的初始努力已直接朝着工程病毒方向前进，这种病毒可作为载体去携带治疗基因进入病人。近期曾发表大量有关基因治疗方面的文章。这些文章将依次确认了各种病毒的分类。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【公告】2009年医师资格考试的新大纲 |
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2008-03-17 21:54 体细胞基因治疗的三种类别 第一种是离体（ex vivo）,这种方法是将细胞从人体中移出，用载体孵化后形成的基因工程细胞再回至人体中，这种步骤常用于血细胞，因为它们最容易被移进移出。 第二种方法是在位点（in situ）上，这种方法是直接将载体放入需治疗的组织中去。例子是把腺病毒载体浸入带囊纤维病人的气管和支气管中，用携带细胞素或毒素基因的载体注入肿瘤，或将携带有肌细胞增强蛋白的基因直接注入具肌肉营养障碍病人的肌肉中。 第三种方法是在活体（vivo）上，这种方法的载体能被直接注入血液中，这第三种方法还未有临床例子，但如果基因治疗作为一种治疗选择来完成它的承诺的话，必须开发体内可注入载体。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【资源】阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征专家共识（2007年草案） |
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2008-03-17 22:06 以RNA病毒为基础的载体 逆转录病毒一开始就作为最有希望的基因转化载体来选择的，目前利用逆转录病毒的临床试验占了所有被认可报告的60%。因为RNA病毒能执行将有效基因转化至许多类型细胞中去的任务并能稳定地把它们集合到寄主细胞的基因组中（图1），因而也就提供了长期表达的可能性。因为逆转录病毒已被结合进有关的非致病源寄生物中，所以它有最小的危害性（虽然有例外，例如人类免疫缺陷病毒“HIV”和人类T细胞亲淋巴病毒“HTLV”），尤其是鼠白血病病毒（MULV）已被传统地用于临床基因治疗试验选择，曾开发了把载体基因组封入病毒颗粒的各种包装系统。已被移去所有病毒基因的载体本身是充分复制缺陷并接受达到大约8Kb（Kilobase）外源性DNA。 研究人员若要开发高效治疗疾病的逆转录病毒载体，将面临四个关键问题：获得高效输送、传导非分离细胞、维持长期的基因表达和开发制造载体的经济方法。 获得高效输送。采用逆转录病毒的临床试验报告主要使用体外方法。目前，采用逆转录载体传导的细胞，它们具有高水平的天然MuLV(amphotropic)受体并在暴露载体的时间里进行分离。虽然有少量细胞类型不能被分离，但能在体内生长的大多数细胞能被传导。一种重要的靶细胞是初级的钩状促白细胞生长素干细胞（HSC），因为基因传导进入这类细胞将为受体生命产生基因工程细胞。然而，HSCs有一种低水平的酸-碱兼性受体，它具弱传导性。因此，HSCs仍是重要的目标但难以捉摸。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 告别2008 |
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2008-03-17 22:07 具有兼性受体的广泛范围的细胞类型据知是磷酸盐同向运转，这种磷酸盐限制了这些受体在体内方法中特殊目标的运用。使用不同的病毒包封认识不同受体的蛋白质，（例如，囊状口炎病毒（VSV）-G蛋白或gibbon类人猿白血病病毒（GALV）包封蛋白）,能改变受到传导的细胞范围，但仍不能提供更多特异性。其困难在于，因为逆转录病毒不能在高滴定度上产生，（兼性受体将被限制于每毫升形成1×107菌落单位和假型VSV-G受体至每毫升1×109CFU），这不可能为in vivo期望的细胞类型得到大量的受体颗粒。病毒颗粒将被束缚于它们遭遇到的许多细胞中，这样，在它们到达它们的目标之前就已被稀释出去。（其它的组织，例如中间补体消失将在后面讨论）。问题能定量化，人体包含大约5×1013细胞，如果一个病人得到100毫升逆转录病毒样品，那大约是1×109活性载体颗粒。即使每一受体颗粒对感染是100%特异性，只要有1/50000细胞被传导。需要的东西是优先束缚于它的目标的逆转录病毒颗粒并能在高滴定度上制造出来。 对特殊靶细胞类型的探索已集中于企图建造天然逆转录病毒包封蛋白上。包封蛋白有两种功能：束缚于它的受体，（通过表面（SU）部分）能进入病毒核蛋白核心中（主要由转导膜（TM）部分执行）。SU蛋白束缚于靶细胞表面的受体上，因此，经SU/TM络合，使病毒和细胞膜产生结构变化，接着病毒核（带有病毒的遗传信息）进入靶细胞的细胞质中。 提供靶细胞特殊性的两种主要方法继续进行。首先，SU蛋白的天然束缚受体区域曾被配体或认识特殊细胞表面受体的单链抗体所代替，曾靶向范围广泛的收体。但是困难在于，即使在工程化载体和靶细胞受体之间能获得特殊束缚，在实验中的基因转化仍很低。理由是清楚的，想象逆转录病毒包封蛋白将变成了具有络合四元结构的三聚体。当天然束缚区域被外来序列取代时，整个包封蛋白的结构发生变化，结果产生新的蛋白构象，这种改变导致了不能发生病毒和细胞膜之间的融合，没有融合就不能发生有效的核进入和基因转化。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【资源】阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征专家共识（2007年草案） |
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2008-03-17 22:07 在创建US的束缚受体区域的同时，为执行核进入而保持包封蛋白的能力将需要更好地掌握包封络合蛋白中的结构—功能关系。这种认识随着最近发表的有关鼠亲病毒SU蛋白束缚受体区域的三维结构而获得进展。工程化配体嵌进具有为核进入而保持包封蛋白功能性高机率的SU蛋白中的各个特殊位置，目前成为可能。 逆转录病毒包封蛋白的另一个结构—功能研究也有助于我们理解在束缚后如何获得高效的核进入。去年发表了Moloney亲病毒逆转录病毒TM蛋白的部分三维结构。最近在预见包封蛋白的三聚结构中，已显示出它的分离单体能彼此交联。换句话说，每个有缺陷的分离单体，彼此能互补以便提供一种活性三聚体包封。运用这种工艺有可能去定义TM蛋白中的分离功能区域。当使完成包封蛋白三维结构和功能区域变成可知时，具有高效靶特性细胞的结构逆转病毒载体有可能产生。 运用第二种主要的称之为“链”（tethering）靶方法曾获得进展。虽然曾设计了几种创造性系统，但目前最成功的方法是将认识细胞外基质（ECM）成份的配体嵌进不能扰乱天然束缚受体区域的部分SU蛋白中。链（tethering）浓缩靶细胞附近ECM中的载体。然后束缚受体和核进入通过天然包封—受体机理产生。出现特别用于基质的两种配体是特性溶胶、纤维结合素。纤维结合素是存在于正常的ECM中，暴露的溶胶存在于危险区域，例如，血管成形术后心血管系统伤口损伤处。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【讨论】病例：双肾盂，双输尿管畸形 |
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2008-03-17 22:08 非分离细胞的传导。 虽然基于MULV的逆转录病毒载体不能去传导非分离细胞这点在某些状态非常有用，例如，当毒素基因被嵌进分离癌细胞并不会进入正常的非分离细胞（见下面的“临床试验”），在许多状态中，有一种要求即把一种治疗基因嵌进正常的非分离细胞中。许多潜在的靶细胞不会激活分离活体；只有某些血细胞（而不是干细胞）和细胞衬里胃肠束继续分离。慢病毒（例HIV—1）能够感染非分离细胞，因为再结合能产生致病原病毒的可能性而使这些病毒来的载体结构超过安全范围。企图转化至鼠逆转录病毒，结果从允许传导非分离细胞HIV来的特殊信号没有获得成功。最近，有可能在逆转录病毒中使用刚好22%的HIV基因组（不包含任何引起病源体的基因）。由于使用了非—HIV外膜蛋白而进一步减少了再结合的机会。杂交系统（hybrid system）以同样的方式为提供体内传导非分离细胞的选择负有重大责任。另一种正在开发的RNA病毒是根据人类泡沫病毒来开发的。这些载体能传导广泛范围的细胞类型，不能被人类血清激活，并有可能传导某些非分离及分离细胞。 改进基因表达。假设开发高效的基因能传导的话，那末接下来的目标便是使基因表达长效稳定在一个合适水平上，这正是当前载体最大的不足。虽然我们仅是在逆转病毒载体中讨论基因表达问题，但它可应用到所有类型的基因传导载体中。 基因转化后要保持稳定的表达，与几种因素有关。首先，控制基因表达的调节顺序不能经常保持活化状态。存在一种细胞认识外来催化剂的的趋势，（尤其如类人猿病毒40（SV40）和巨细胞病毒（CMV）），并不能激活它们（通过甲基化或其它机理）。到目前为止，仍很少掌握淋巴激活素、细胞素和其它生长因素在基因表达中的作用。其次，即使基因在细胞中保持活性但细胞经常死亡。为识别、消除外源基因产物及产生外源蛋白细胞而设计免疫系统，从逆转录病毒载体中消除所有病毒基因。所以，病毒蛋白的免疫识别（有一种情况例外，如病毒壳体蛋白被包埋在病毒颗粒中）不是目的（但见下面腺体载体的讨论）。尽管如此，免疫系统仍可能识别由治疗基因产生的新的或修正过的蛋白；一种新合成的正常蛋白将对从未为它暴露过的免疫系统作出反常表现。 细胞自身顺-调节DNA序列的使用将可能比用病毒催化剂获得更稳定长效基因表达，但要确认基因调节系统的所有成分可能是困难的。作为一种极端的情况，与血红蛋白（B-珠蛋白）基因部分调节有关的调节序列扩散超过近100kb。因为逆转录病毒仅能提供6—8Kb序列，所以被结合到这种载体前可能需要截断调节序列至它们的最小基本长度。甚至当使用天然调节分子时，因缺乏微弱信号和适宜细胞环境的正常操作反馈机理而不能校正功能。例如，当胰岛素增强剂/催化剂输送至成纤维细胞中去时仍不能调节表达。再有，要强调的是：需要开发具有基因转化成特殊细胞型能力的载体。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【资源】检验与护理 |
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2008-03-17 22:09 非分离细胞的传导。 虽然基于MULV的逆转录病毒载体不能去传导非分离细胞这点在某些状态非常有用，例如，当毒素基因被嵌进分离癌细胞并不会进入正常的非分离细胞（见下面的“临床试验”），在许多状态中，有一种要求即把一种治疗基因嵌进正常的非分离细胞中。许多潜在的靶细胞不会激活分离活体；只有某些血细胞（而不是干细胞）和细胞衬里胃肠束继续分离。慢病毒（例HIV—1）能够感染非分离细胞，因为再结合能产生致病原病毒的可能性而使这些病毒来的载体结构超过安全范围。企图转化至鼠逆转录病毒，结果从允许传导非分离细胞HIV来的特殊信号没有获得成功。最近，有可能在逆转录病毒中使用刚好22%的HIV基因组（不包含任何引起病源体的基因）。由于使用了非—HIV外膜蛋白而进一步减少了再结合的机会。杂交系统（hybrid system）以同样的方式为提供体内传导非分离细胞的选择负有重大责任。另一种正在开发的RNA病毒是根据人类泡沫病毒来开发的。这些载体能传导广泛范围的细胞类型，不能被人类血清激活，并有可能传导某些非分离及分离细胞。 改进基因表达。假设开发高效的基因能传导的话，那末接下来的目标便是使基因表达长效稳定在一个合适水平上，这正是当前载体最大的不足。虽然我们仅是在逆转病毒载体中讨论基因表达问题，但它可应用到所有类型的基因传导载体中。 基因转化后要保持稳定的表达，与几种因素有关。首先，控制基因表达的调节顺序不能经常保持活化状态。存在一种细胞认识外来催化剂的的趋势，（尤其如类人猿病毒40（SV40）和巨细胞病毒（CMV）），并不能激活它们（通过甲基化或其它机理）。到目前为止，仍很少掌握淋巴激活素、细胞素和其它生长因素在基因表达中的作用。其次，即使基因在细胞中保持活性但细胞经常死亡。为识别、消除外源基因产物及产生外源蛋白细胞而设计免疫系统，从逆转录病毒载体中消除所有病毒基因。所以，病毒蛋白的免疫识别（有一种情况例外，如病毒壳体蛋白被包埋在病毒颗粒中）不是目的（但见下面腺体载体的讨论）。尽管如此，免疫系统仍可能识别由治疗基因产生的新的或修正过的蛋白；一种新合成的正常蛋白将对从未为它暴露过的免疫系统作出反常表现。 细胞自身顺-调节DNA序列的使用将可能比用病毒催化剂获得更稳定长效基因表达，但要确认基因调节系统的所有成分可能是困难的。作为一种极端的情况，与血红蛋白（B-珠蛋白）基因部分调节有关的调节序列扩散超过近100kb。因为逆转录病毒仅能提供6—8Kb序列，所以被结合到这种载体前可能需要截断调节序列至它们的最小基本长度。甚至当使用天然调节分子时，因缺乏微弱信号和适宜细胞环境的正常操作反馈机理而不能校正功能。例如，当胰岛素增强剂/催化剂输送至成纤维细胞中去时仍不能调节表达。再有，要强调的是：需要开发具有基因转化成特殊细胞型能力的载体。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【资源】检验与护理 |
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2008-03-17 22:10 根据各方面的稳步进展，长久、稳定和适宜的体内基因，将在广泛范围细胞型中完成表达。一旦清除了这些障碍，那么下一步的目标将是获得能调节的基因表达。许多重要的靶基因，例如，胰岛素不能在所有时间表达在同样水平上，而且应答体内的生理信号。目标是使用应答体内自身的生理信号（为此嵌入的治疗基因起到内源基因运行的作用）或者输送能控制基因活性水平的药物。在某些情况下，仅保持基本不起调节表达的低水平可能是有利的，（例如，血友病或腺苷脱氨基酶（ADA）缺陷），而在另一种情况下，可能需要牢固的调节（例如。糖尿病中的胰岛素生产）。 制造载体。虽然10年前，医药公司还不能生产上百万基因治疗载体药片，现在却能够了。逆转录病毒载体是生物剂：它们只能从活体细胞中制得。生物学系统在执行由食品和药物行政管理机构制定的产品制造工艺（GMP）、质量安全/质量控制步骤上（GA/GC），不是件最容易的事，疫苗生产已经学到了。 与逆转录病毒载体相关的主要问题之一，是有可能在制造过程中增加复制活性逆转录病毒。因为，逆转录病毒载体是在包裹缺陷病毒基因组的包裹细胞中生产出来的，因为逆转录病毒载体有高的再结合倾向，所以上述的可能性出现了。进一步说，当每一个哺乳动物包含内源逆转录病毒时，附加的病毒序列可能被结合进RCR，或许就产生了致病源病毒。 另一个潜在的问题起因于逆转录病毒载体随机结合进入寄主细胞DNA中的能力。例如载体可能自身嵌进肿瘤超表达基因中去，这样就增加了细胞演变成癌细胞的倾向。1992年发表了在大型动物逆转录病毒基因转化实验中，出现唯一并不要求产生肿瘤的例子。在10只猕猴的骨髓受到辐射破坏时，报道了淋巴瘤的三种情况，然后用曾对大量RCR（而不是逆转录病毒载体）和实验载体暴露过的造血干细胞，做骨髓移植，结果表明产生了RCR集聚的癌，是交流活动且仅是在逆转录病毒6---7个月后发展起来的。 RCR生产及其潜在的肿瘤生产课题在对NIH重组体 DNA顾问委员会（RAC和FDA）的报告中被广泛地作了分析。结论是目前根据FDA要求采用的QA/QC步骤极不可能使得任何病人接受充分的RCR以便既产生逆转病毒血液又产生恶性肿瘤。然而，制造和试验过程确信安全的程度是复杂而昂贵的。 当目前研究的目标是把生产的基因治疗载体直接注射进人体时，（恰如青霉素和胰岛素），必须考虑到其它问题。例如，鼠包裹细胞产生逆转录病毒载体，它遭到人体活性的破坏。虽然敏感性使得载体颗粒“安全”，它显著地减少他们体内的半蓑期和基因传导的效率。产生敏感的主要成分起因于在病毒糖蛋白上唯一存在的糖基，而病毒糖蛋白产生于使病毒颗粒对人体活性系统敏感的鼠包裹细胞上。或者让鼠细胞上产生的载体颗粒工程化以避免人体活性系统，或者载体需产自非鼠包裹细胞线，在这条生产线上生产出的载体表面能提供合适糖基的病毒颗粒。然而，正如以上所述，基本上所有的哺乳动物细胞有他们自己的内源逆转录病毒，而这些内源逆转录病毒载体能与载体再结合，结果产生新的潜在致病源RCR；许多内源病毒仍然是未知的。虽然任何细胞线是值得怀疑的，但灵长类或人类细胞作为包裹细胞在涉及的相关点上达到了最大的安全性。然而，人类包裹细胞只有工程化才非常安全，例如，在从env基因中分离出DNA的结构上，产生病毒gag—pol基因及其它安全特点的ProPak细胞线，一定要比鼠包裹线PA317更安全，它是目前用得最多的逆转录病毒载体临床试验。 这些课题是可解决的，但为面向世界市场生产安全、高效基因治疗载体而开发低成本制造系统，将花费几年的产品发展。虽然避免许多问题的非病毒输送系统可能是将来的基因治疗载体（见下面的“非病毒载体”），许多目前和将来运用逆转录病毒载体的临床试验，需要解决安全和高效的制造课题。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【资源】孙建方教授-带状疱疹资料 |
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2008-03-17 22:10 根据各方面的稳步进展，长久、稳定和适宜的体内基因，将在广泛范围细胞型中完成表达。一旦清除了这些障碍，那么下一步的目标将是获得能调节的基因表达。许多重要的靶基因，例如，胰岛素不能在所有时间表达在同样水平上，而且应答体内的生理信号。目标是使用应答体内自身的生理信号（为此嵌入的治疗基因起到内源基因运行的作用）或者输送能控制基因活性水平的药物。在某些情况下，仅保持基本不起调节表达的低水平可能是有利的，（例如，血友病或腺苷脱氨基酶（ADA）缺陷），而在另一种情况下，可能需要牢固的调节（例如。糖尿病中的胰岛素生产）。 制造载体。虽然10年前，医药公司还不能生产上百万基因治疗载体药片，现在却能够了。逆转录病毒载体是生物剂：它们只能从活体细胞中制得。生物学系统在执行由食品和药物行政管理机构制定的产品制造工艺（GMP）、质量安全/质量控制步骤上（GA/GC），不是件最容易的事，疫苗生产已经学到了。 与逆转录病毒载体相关的主要问题之一，是有可能在制造过程中增加复制活性逆转录病毒。因为，逆转录病毒载体是在包裹缺陷病毒基因组的包裹细胞中生产出来的，因为逆转录病毒载体有高的再结合倾向，所以上述的可能性出现了。进一步说，当每一个哺乳动物包含内源逆转录病毒时，附加的病毒序列可能被结合进RCR，或许就产生了致病源病毒。 另一个潜在的问题起因于逆转录病毒载体随机结合进入寄主细胞DNA中的能力。例如载体可能自身嵌进肿瘤超表达基因中去，这样就增加了细胞演变成癌细胞的倾向。1992年发表了在大型动物逆转录病毒基因转化实验中，出现唯一并不要求产生肿瘤的例子。在10只猕猴的骨髓受到辐射破坏时，报道了淋巴瘤的三种情况，然后用曾对大量RCR（而不是逆转录病毒载体）和实验载体暴露过的造血干细胞，做骨髓移植，结果表明产生了RCR集聚的癌，是交流活动且仅是在逆转录病毒6---7个月后发展起来的。 RCR生产及其潜在的肿瘤生产课题在对NIH重组体 DNA顾问委员会（RAC和FDA）的报告中被广泛地作了分析。结论是目前根据FDA要求采用的QA/QC步骤极不可能使得任何病人接受充分的RCR以便既产生逆转病毒血液又产生恶性肿瘤。然而，制造和试验过程确信安全的程度是复杂而昂贵的。 当目前研究的目标是把生产的基因治疗载体直接注射进人体时，（恰如青霉素和胰岛素），必须考虑到其它问题。例如，鼠包裹细胞产生逆转录病毒载体，它遭到人体活性的破坏。虽然敏感性使得载体颗粒“安全”，它显著地减少他们体内的半蓑期和基因传导的效率。产生敏感的主要成分起因于在病毒糖蛋白上唯一存在的糖基，而病毒糖蛋白产生于使病毒颗粒对人体活性系统敏感的鼠包裹细胞上。或者让鼠细胞上产生的载体颗粒工程化以避免人体活性系统，或者载体需产自非鼠包裹细胞线，在这条生产线上生产出的载体表面能提供合适糖基的病毒颗粒。然而，正如以上所述，基本上所有的哺乳动物细胞有他们自己的内源逆转录病毒，而这些内源逆转录病毒载体能与载体再结合，结果产生新的潜在致病源RCR；许多内源病毒仍然是未知的。虽然任何细胞线是值得怀疑的，但灵长类或人类细胞作为包裹细胞在涉及的相关点上达到了最大的安全性。然而，人类包裹细胞只有工程化才非常安全，例如，在从env基因中分离出DNA的结构上，产生病毒gag—pol基因及其它安全特点的ProPak细胞线，一定要比鼠包裹线PA317更安全，它是目前用得最多的逆转录病毒载体临床试验。 这些课题是可解决的，但为面向世界市场生产安全、高效基因治疗载体而开发低成本制造系统，将花费几年的产品发展。虽然避免许多问题的非病毒输送系统可能是将来的基因治疗载体（见下面的“非病毒载体”），许多目前和将来运用逆转录病毒载体的临床试验，需要解决安全和高效的制造课题。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【资源】检验与护理 |
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2008-03-17 22:12 删除越来越多的病毒基因并不总是先进的方法，因为某些基因可作出有益的贡献，例如，抑制了对抗载体的免疫应答，它们的被删除可能增加了载体被消除的速度，举个例子，E3区域编码保护病毒的相对分子量为19K蛋白，可从寄主免疫监督中设计细胞。各种有效的机理被包括在病毒载体的清除中，同?认允拘蛄锌砂镏?保持腺嘌呤基因组在细胞中的稳定性。作为药物试验，动物总不能反应病人发生的东西，在灵长类中产生炎症应答的载体可能不会在人类病人中发生，而相反的情况则可能发生。最近，第一个“真正”一期基因治疗临床试验已经开始：为了确定对人体腺嘌呤载体的免疫应答，对照志愿者已经进行腺嘌呤载体皮下注射试验（现在采用支气管注入），目的是测定人体对腺嘌呤载体的免疫应答。 通过设计病毒基因的正确结合（可能掺合各种来源的免疫抑制基因，同时消除刺激免疫基因产物和减少病毒壳体蛋白免疫遗传），不能被培育的腺嘌呤载体可能有低的毒性度，不产生免疫应答，因此会重复出现。这后一种观点是是重要的，因为腺嘌呤载体不会集成并在细胞中幸存有限的时间（虽然在非分离细胞中可能延长间隔时间）。 管理载体重复性的能力在许多治疗报告中将是严格的，例如，在血友病及囊纤维中便是如此。虽然设计不能激发免疫应答的载体将是昂贵的选择，但间歇应答能用于病人的瞬时免疫限制，以便允许载体的重复管理。另一方法是需要为抗原的免疫应答作阻止共刺激的相互作用，进行载体管理期的瞬时“束缚”免疫系统并使重复管理成为可能。 与腺嘌呤相关的病毒载体。运用于临床试验的另一个DNA病毒是与腺嘌呤相关的病毒AAV。（这是一种非致病源病毒，它广泛分布于人类人群中（大约人类的80%有直接抗AAV的抗体）开始对这种病毒产生兴趣是因为只知道哺乳动物病毒优先集成进入基因组的特殊区域（进入人类短臂染色体）。当该病毒不产生疾病时，它的嵌入位置出现在基因组的安全区域。因此可用于设计支配把特殊位置嵌进基因治疗载体。不幸的是，虽然曾建议设计保留某些特殊性的载体，但目前的载体出现了整合进入非特殊区域的现象。 即使还不曾获得整合位置特殊性，AAV曾显示出传导脑、骨骼肌肉、肝和合理的CD34+血细胞效应。然而，存在几种缺点：某些细胞需要非常高的复杂感染（为获得传导需要的每个细胞病毒颗粒数量）；AAV是小的，仅允许添加4.8kb大小的DNA；因为高效包裹细胞还没有开发，所以病毒颗粒的生产仍需花费心血；然而这些载体充满希望并呈现安全。进一步认识到，虽然预期野型病毒再会从载体中失去，但AAV有能力整合进入非分离细胞，而且以附加体状态保留直至细胞分离发生。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【原创】全国共享治疗疼痛及妇科炎症的最新技术 |
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2008-03-17 22:13 依据其它DNA病毒的载体 其它DNA病毒正在有可能为特殊情况当作基因治疗载体而研究。例如， 疱疹单一病毒（HSV）载体有为神经系统及几种其它类型细胞传导细胞的自然倾向。HSV剥离下来的部分叫amplicon,它具有一定的先进性，尤其是与其它病毒系统成分结合时，包括痘病毒的大量DNA病毒正在研究中。几个研究人员正在考察病毒（DNA和RNA）的复制活性或被减弱性。此外，杂交系统曾被报道，在这篇报道中，腺嘌呤病毒通常把逆转录病毒导入不能正常达到逆转录病毒传导的细胞中。 非病毒载体 虽然病毒系统是潜在的高效，但对将来作参考选择的非病毒基因输送系统提出两种建议：安全，制造方便。能设计出全部合成基因输送系统以避免产生结合病毒的危险，或由生物活性病毒颗粒工程化的其它毒素效应。还有，生产成品产品不应该比想象中的细菌那种组织细胞培养更复杂。QA/QC步骤应简单化。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【原创】全国共享治疗疼痛及妇科炎症的最新技术 |
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2008-03-17 22:14 基因治疗的临床应用 截止1998年底只有一个III期几个II期临床试验在进行；所有其它认可的基因治疗试验报告是小规模的I/II期试验。基因治疗公司/Novartis正在进行III期临床试验。治疗的疾病是多形成胶质细胞瘤，一种恶性脑肿瘤。治疗时，合理地把有能力杀死肿瘤细胞的基因嵌入肿瘤块中而保护正常的脑细胞。使用的逆转录病毒载体（G1TkSvNa）包括作为选择标记的抑制新霉素和疱疹单一胸苷激酶基因。真正注入肿块的的材料是鼠产细胞线（PA317）上生产，，它产生一种携带G1TkSvNa载体的逆转录病毒颗粒。由于脑肿瘤生长区域中的唯一分离细胞是肿瘤细胞，并由血管系统的细胞供血给肿瘤，逆转录病毒只传导分离细胞，接受载体的唯一细胞应该是肿瘤细胞和它的血液载体。病毒HSTK能把一个磷酸盐基团加到不带磷酸盐基团的核苷上，而内源的人体胸苷激酶却不会接受磷酸盐基团。因此，象药物ganciclovir这种异常的核苷提供给病人时，只有表达HSTK基因的细胞将磷酸脂化药物，并一起进入DNA合成环节中，最终被杀死。 在近期的III期试验中，把携带HSTK基因载体颗粒的鼠产细胞接种到残留肿瘤和肿瘤周围区域，接下来切除肿瘤。五月后，病人接受了ganciclovir的治疗。理论上，采用包括HSTK基因的载体传导的肿瘤细胞将磷酸脂化ganciclovir; 然后ganciclovir三磷酸盐封闭DNA合成环节并杀死它们。 事实上，在试验报告中，提出了四个不同的肿瘤死亡机理。第一，磷酸脂ganciclovir对肿瘤细胞传导的直接作用；第二，“旁观者”效应，即杀癌毒素剂（ganciclovir三磷酸盐）通过间隙进入邻近细胞并杀死它们；第三，由注射鼠细胞引起的自身局部炎症；第四，系统性免疫应答。III期临床试验在北美和欧洲占了总数的40%多，总共达250名病人，到1997年报2月底前，超过200名病人接受治疗。 几个II期试验正在把基因治疗载体作为“疫苗”来试验，既抗癌又抗AID。Vical有两个积极的II期试验，在该试验中，使用了配有阳离子16脂质的HLA—B7/B2—微球蛋白的基因质粒。一个试验是为转移的恶性黑色素癌，另一个是为头和颈的磷片状癌。概念是把不表达肿瘤的HLA基因注射进肿块，而表达的外部抗原应该刺激免疫系统产生抗癌的反应。所以资料建议免疫系统不仅发展抗B7抗原的应答，而且还有针对其它肿瘤细胞的抗体。由此而来产生对非传导肿瘤细胞的免疫进攻。Viagen/Chiron在过去的两年里已经完成了大约200个病人的试验，在试验中，为诱导作为治疗AID而增大抗--HIV细胞毒素T—细胞的应答。把编码有HIV—1（IIIB）键env和rev基因片段的逆转录载体注射进肌肉。不幸的是，为HIV感染采用三倍药物治疗方法不可能决定治疗效应，但没有看到毒素的迹象。 最后，谈论一下原始的腺苷脱氨酶（ADA）缺陷基因治疗试验，ADA缺陷是一种在儿童中产生严重免疫缺陷的罕见遗传疾病，自1990年开始，为医治这种疾病给两个女孩作了自身T—淋巴细胞的基因矫正，两个女孩子都做得很好，并继续获得正常的生活。病人1（A.D.）接受了总共11次的注入，最后一次接受注入是1992年夏天，她的总体T—细胞水平和她传导T—细胞的水平在过去的五年时间里保持基本衡定。她随后在1996年感染了水痘，为期望获得正常的十年生活，经历了相同临床病程。病人1和病人2（C.C）都继续接受聚乙烯葡萄糖（PEG）--ADA治疗。虽然两个女孩子都在后来的七年多时间里，在她们的循环中存在基因工程T—淋巴细胞。但还不能在她们明显的临床试验中就有关PEG—ADA和基因治疗的相关作用作出明确的结论。 美通过基因疗法修复心脏的起搏功能 美国科学家通过基因疗法修复心脏细胞的起搏功能，已在动物实验中取得成功。这一方法将来有可能取代昂贵而又危险的电动心脏起搏器。 心脏起搏细胞的功能是产生生物电刺激，使心脏有节律地跳动。在成年人的心脏里，起搏功能局限于一小部分细胞中。由于衰老和疾病，这些起搏细胞会死亡或失效，引起心脏病。全世界每年约有６０万病例通过手术植入电动心脏起搏器。起搏器虽然挽救了许多人的生命，但也存在需要更换电池、不能接近强磁场的缺点。 据新华网消息，美国约翰?霍普金斯大学的科学家在１２日出版的英国《自然》杂志上发表报告说，他们使用基因疗法，改变心脏细胞内外的化学物质流向，产生电压，使普通细胞“变”成了起搏细胞，刺激心脏跳动。 细胞中有一种蛋白质，能像水泵一样使带正电的钾离子流进细胞内部。研究人员使用一种病毒为载体，将一个基因释放到细胞中，产生另一种蛋白质干扰“钾离子泵”的作用。这样，细胞内外部就产生负电位，形成的电信号刺激其它心脏细胞收缩。 科学家说，只需要对几千个细胞进行基因改造，就能达到起搏的目的。他们已经在豚鼠身上取得了初步成功，下一步将在猪身上做试验。科学家希望该技术４年内能够付诸实用，成为一种比电动起搏器更安全、成本更低的疗法。 不过在实际应用之前，这项技术还需要不断完善，以保证经转基因处理的细胞起搏功能正常，并且把这种处理限制在合适的范围内，避免不适当的细胞获得起搏功能，导致心跳节律失常。 基因疗法副作用引发疑虑 最近，法国一名接受基因治疗的患者得了白血病，这引起了巨大反响。因此，美国和日本先后决定暂时停止进行基因治疗。日本今后一面关注欧美的动向，一面决定是否恢复基因治疗。九月上旬，法国一名接手基因治疗的幼儿患了白血病，这一消息使日本的医务人员产生了动摇。当时，东北大学附属医院和北海道大学附属医院正准备对患者实施与法国相同的基因治疗方法。 法国接受基因治疗的幼儿是一名X染色体基因发生突变，无法制造出有免疫能力的淋巴球的疑难病患者。医生的治疗方案是：以病毒为载体，在形成血液细胞的造血干细胞中植入正常基因，来对患者进行治疗。然而，病毒进入了使造血干细胞变成白血球的基因中去，结果刺激了会反复繁殖的癌基因，导致白血球异常增多。 在目前的基因治疗中，医生还无法预测病毒会进入染色体的哪个部分。日本医科大学教授岛田隆指出，从理论上讲，基因治疗产生这种副作用的几率为一千万分之一。 法国有11名患者接受了基因治疗。患白血病的只有1名患者，有9名患者的治疗效果良好。基因治疗已有10多年的历史。发生这种始料不及的情况，可以说“影响很大”。 各国对这件事做出了不同反应。法国决定暂时停止基因治疗，英国准备在观察每一个患者的情况后再作决定。德国今年初发表了一篇关于一只老鼠在接受基因治疗实验中患白血病的论文，随即决定停止进行临床应用。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【试题】护师资格考试试题 |
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2008-03-17 22:15 基因治疗的伦理道德和安全思考 伦理道德 现在为治疗严重疾病，从伦理道德观念上接受了体细胞基因治疗。的确，之所以如此好的接受是因为从基因治疗中试验所产生的副作用是如此小，以致于基因工程目前存在的危险可用于非疾病的条件上，即用于功能增强和美容目的。1997年九月，由NIH RAC组织的第一次基因治疗政策会议瞄准了这一方向。结论是增强工程可以产生，但如果RAC和FAD（在其它国家里是小组织）不警惕的话，也可能使调节过程失控。举个例子，美国生物工程公司已经开发了一种把基因转入发囊细胞的技术，他们现在正在寻找用于临床目的的促头发生长的基因，这种基因能使癌症病人化疗后脱落的头发再生长出来。FAD把产品认证应用编列于化疗诱导脱发产品说明书中，这儿的危险---有利分析非常重要。然而，一旦产品为任何一种说明所认可的话，它能被内科医生当作任何“脱离标签”使用，产生被内科医生当作临床正常药方使用的感觉。其结果可能成千上万的秃顶男人为治疗他们的脱发而接受基因治疗。会议要求FDA应该考虑到可能扩大至美容上的无标签使用而应使用利弊分析。 当然，用基因工程去治疗秃发不是它本身的主要目的，但这恰恰是我们的社会正朝小心把基因工程很好用于大范围的增强意图运行的一个例子，还包括大量使用生长荷尔蒙基因，它能从肌细胞增强蛋白基因中增加肌肉，如此等等。如果我们知道不会产生基因工程的长期负面效应，然后扩大，甚至轻率地使用基因工程技术可能不会有害。但是恰如拥有核能、农药和碳氟化合物一样，我们作为社会趋向既要看到有利的一面，又要警惕由于具有新技术而带来的负面的一面。社会从现在起，有关基因工程不仅要考虑100年的商业行为，而且以一种尽可能的相应法规开始基因工程时代是我们的责任。直到我们学到有关体细胞基因治疗在疾病治疗中的长期效应后，我们不应该为超越医疗提示的其它目的而使用这一技术。 在可预见的将来将进行胎儿子宫体细胞基因治疗，为成人、儿童和婴儿进行与体细胞基因治疗试验一样的治疗。只要靶向严重的疾病，并且母亲和胎儿的利弊比例可被接受，子宫基因治疗符合合适的伦理观。种系基因治疗不应在此时为概念延伸的理由而尝试进行试验。 具有真正滥用新技术的潜在形势将是克隆和遗传工程的相结合，这种结合已经在羊的试验中获得成功，在羊的试验中，从胎儿成纤维细胞中获得单细胞，经转基因后，基因工程细胞成长成生产人类因子IX的活体羊。试图使用生产遗传工程人类的这种技术将激发一场甚至比在芝加哥科学家克隆人类的更大的伦理道德风暴。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【讨论】病例：双肾盂，双输尿管畸形 |
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2008-03-17 22:16 安全考虑 A 危险评价 A-1．危险组 危险评价基本上是一种主观方法。研究人员必须根据危险组的因素（see Appendix B,Classication of Human Agents Basis of Hazard）做出初始的危险评价。按照影响成人健康的致病源，因素被分为如下四类危险组：1，危险组1（RG1）因素是与成人健康疾病无关；2，危险组2（RG2）因素是与人类相当严重的疾病相关，需经常采用防治或治疗干预；3，危险组3（RG3）因素是与严重的或致死的人类疾病有关，对此类疾病可进行防治和治疗干预；4，危险组4（RG4）因素，是可能引起严重的或致死的人类疾病，对此类疾病通常不能采用防治或治疗的干预。 A-2．危险组的评判标准 根据Harzard的人类病因学因素分类的附录B，因素的分类是根据生物因素不相识对人类健康的潜在效应，而不是考虑个体对某一因素可能已增加敏感的例子，例如预先存在的疾病、药疗、妥协的免疫、妊娠和乳汁喂养（它可能增加婴儿对某些因素的暴露）。 个人可能需要定期的医疗监护，以查明适合执行某些活动的情况，有待为他们提供预防疫苗和增强剂的可能性。（见IV-1-f,规则的责任，总的信息） A-3．综合危险评价 在决定合理的实验控制时，根据Hazard基础的人类病因学因素分类附录B制定的初试危险评价，应通过全面考虑因素本身和如何熟练使用它来进行，在决定控制水平中有待考虑的因素包括：毒性、致病源、感染剂量、环境稳定性、常规扩散、交流、操作、数量、疫苗或治疗的有效性、基因产生的毒素、生理活性和过敏性。众所周知比父母种系更冒险的种系因素应被掌握在更高的控制水平上。确定的减弱种系或已论证有不可逆毒性损失因素的种系可比指定父母种系的危险组更有资格降低控制水平（见V-B部分，I-V部分的脚注和参考）。 然后，根据上述考虑的最终危险评价，常用于为实验设置合适的控制条件（见II-B部份，控制）。要求的控制水平可等同于因素的危险组分类，或者它可能提高或减低上述认可的结果。生物安全委员会机构必须为重组DNA实验，办理批准危险评价和生物安全控制水平手续。生物安全委员会在批准过程中按他们制定的有关文件进行，其中包括：III-A，要求机构生物安全委员会批准的实验，RAC综述和实施前NIH负责人批准；III-B，实施前要求NIH/OBA和生物安全委员会批准的实验；III-C，实施前要求生物安全委员会机构，机构综合委员会批准并在NIH/OBA注册的实验；III-D，实施前，实验要求生物安全委员会批准的实验。 应仔细考虑某些更高危险组因素的操作计划，例如，在生物安全水平（BL）2控制下可培养RG2登革热病毒，（see SectionII-B）；然而，当这样的因素用于动物接种或移植研究时，就要提出更高的控制水平。同样地，如委内瑞拉马脑脊髓炎和黄传染病毒这样的RG3因素应掌握在动物接种和转化实验的更高控制水平上。 具有人类免疫缺陷病毒（HIV），肝炎B病毒（HBV）或其它的血源性致病菌的独立研究工作应该向Occupatonal Exposure to Bloodborne Pathogens,最终的法规（56FR64175-64182）咨询。为来自全人类，或从HIV-或HBV-感染或接种实验动物来的全部血控制临床标本、体液和组织活动推荐BL2控制。如实验研究室规模生产HIV的数量，或者其它血源性致病菌、操作浓缩病毒制备，或可产生液滴或气雾接触步骤活动，可按辅助实用的BL2简易设备和推荐的BL3控制设备执行。包括HIV工业规模数量或浓缩制备活动可在BL3简易设备中找到。或者，如合适的话，使用BL3实用和控制设备进行BL3大规模生产。 外来植物病源体和本国国内家畜、家禽的动物病源体受到限制，并需要特殊的实验室设计、操作和控制特点，因为在微生物和生物医药实验室的生物安全中没有相对应的规定。（见V-C部分，I至IV部分的注释和参考）有关这些因素的进口、控制和使用信息见V-G和V-H，I至IV的注脚和参考。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【资源】“生病了”的25种说法 |
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2008-03-17 22:16 B．控制 有效的生物安全程序曾在各种实验室里操作多年，有关信息已经已应用于人体控制设备设计，选择的实验步骤运用于执行重组DNA的组织（见V-A部分）I-V部分的注释和参考）。运用的项目依赖于两个类别的机理：  设定一般用于微生物实验室的标准惯例；（ii）提供人体屏障的特殊步骤、设备和实验室装置，这是指按照评估生物危害的用于各种等级的人体屏障。四种生物安全水平被叙述在附录G的人体控制中。这些生物安全水平由实验室实践、工艺、安全设备和适合实施操作的实验室装置组成，它们是以所使用因素强加的潜在危害并为实验室功能和活动为依据的。生物安全水平4提供最精确控制条件，生物安全水平1提供最低的控制条件。包含重组DNA的实验使其达到第三种控制机理，命名为运用高特殊的生物学屏障。天然的屏障使用受到限制：（1），感染特殊寄主的载体或运载体（质粒或病毒），（2），散布和残留在环境中。为提供重组DNA或复制寄主细胞手段的载体，通过许多重要的手段遗传性地设计降低重组DNA散布到实验室外部的可能性。 自完成了这三种控制手段以来，除能建立用于人体和生物屏障的各种结合的不同控制水平外，还稳定地进行标准的实践。把控制的类别分开，目的是让这种结合能方便地按照NIH指导来表达。 由于躯体的大小、为实验所需组织之数量和组织特殊生长的要求不同，所以，躯体控制附录G中所叙述的实验室躯体控制条件，可能不会对所有的组织都适宜。同样地，在附录1生物控制中叙述的微生物控制，可能不适宜于所有组织、特别是更高级的真核生物组织。然而，有效的信息应用于包括重组DNA组织在内的研究设施的设计和使用于既可集成于共生体、致病源又可集成于其它相关的组织的重组DNA实验步骤设计。根据躯体或生物控制原理，信息叙述用于非传统实验设定的躯体控制设备，信息叙述限制或排除不需要建立的特殊实验，、遗传信息的转移和组织弥散出要求的范围。按照这些条件，有效的引导了限制组织的范围。 对于包含植物在内的研究，四种生物安全水平（BL1-P至BL4-P）被叙述在包括植物在内，重组DNA研究的人体和生物控制附录P中。BL1-P是被设计为提供一种适度水平的实验控制，对于这样的适度控制水平，提出了预防生存、转移和重组DNA扩散进入环境可能性的令人信服的生物学证据。或者，在这一附录中，并没有认识和预见事故发生后对环境的影响。BL2-P为植物和某些相关组织的实验设计了更多水平的控制，它认识到植物和相关组织生存、转移或包含组织的重组DNA扩散的可能性，并已预计到这样一种疏忽结果的最低生物学影响。由于人们潜意识地认识到实验对管理或自然生态环境的重大影响，所以，BL3-P和BL4-P为带有植物、某些致病菌和需要特殊控制组织的实验叙述了其它的控制条件。BL1-P依赖于在最普通的绿屋或生长室设备中接受实施研究的科学实践，依赖于为良好的控制有害动物和培养实践而共同可接受的步骤。 BL-1P设备和步骤为植物繁殖和与植物相关的微生物提供了一种修正和保护的环境，为撒播生物活体植物、植物部分和植物相关的微生物提供了采用的潜在控制程度。BL2-P和BL3-P依赖于在绿屋及其周围以最低或防止疏忽植物控制的方式，接受绿屋中与组织感染或侵扰植物接触研究的科学实践。BL4-P叙述了据称提供控制外来植物致病源控制的设备和实践。 对研究动物，是它的大小，或防止使用小实验动物使用的常规主要控制系统的生长要求，四种生物安全水平（BL1-N至BL4-N）被叙述在包括动物在内的重组DNA研究的躯体和生物控制的附录Q中，BL1-N叙述了动物控制，这种动物通过把稳定的重组DNA，或DNA衍生物导入胚胎线，来修正控制，通过包含修正能生存的重组DNA微生物来修正控制，通过被设计成消除修正过的基因组性传导可能性或者从双亲到下一代只经性繁殖传播的重组DNA衍生病毒的传播来修正控制。步骤、实践和设备跟随避免动物之间遗传变化的分类方法。BL2-N叙述了用于与重组DNA-衍生的组织相关的转基因动物的控制，被设计成消除纵向和横向传播的控制。步骤、实践和设备跟随叙述避免动物之间遗传变化或控制节肢动物传播的分类方法。BL3-N和BL4-N为包含认识到公害因子的某些转基因动物叙述更高水平的控制。 在NIH导引的结构中，有必要为不同水平的躯体和生物控制及其应用的实验分类去定义不同的界线条件。这些定义不需去考虑特殊步骤所有目前和预期的信息，对有关的特殊步骤将允许特在不同的条件下进行特殊的实验，而并不要无危险的提示。个人研究人员和机构委员会正加紧设计简单而有效的控制步骤，并把提出的变化推荐给NIH导引以允许使用这些步骤。 不自见，不自明，不自矜，不自伐。 • 【讨论】08年执考分数线之猜想篇 |
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