【原创】***征集各种蛋白质的提取方法***

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【原创】***征集各种蛋白质的提取方法***

番茄老人

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2008-02-19 20:00

开设本帖的目的在于让大家将自己提取蛋白质的方法奉献出来，给他人借鉴。希望大家踊跃跟帖。

番茄老人 edited on 2008-02-19 20:08

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番茄老人

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2008-02-19 20:07

我做的培养悬浮细胞全蛋白裂解的方法：
1.细胞裂解液（pH8.0）的配方：20mM Tris-Cl，1% NP-40, 137mM NaCl, 20mM DTT, 2mM Sodium Vanadate，1ug/mL Aprotinin, 1ug/mL leupetin, 1mM PMSF；配好后分装-20℃保存，其中 PMSF和蛋白酶抑制剂量使用时现加。

2.裂解方法：按1X106细胞/100uL的比例加细胞裂解液,混匀后冰浴30分钟, 12,000rpm, 4℃,离心10min, 实验时取25uL的上清加5uL 6X上样缓冲液煮沸5分钟使蛋白变性后，12000rpm离心5分钟，取上清和预染Marker加样电泳。或-80℃保存备用。

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2008-02-19 20:43

植物组织蛋白质提取方法
方法一：
1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。
2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。
3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃
4、提取上清液，样品制备完成。
蛋白质提取液：300ml
1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml
2、甘油（Glycerol）75ml
3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g
这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！

方法二：三氯醋酸—丙酮沉淀法
1、在液氮中研磨叶片
2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空
干燥沉淀，备用。
4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小
时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮
裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。

这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

不自见，不自明，不自矜，不自伐。

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2008-02-21 14:09

细胞核浆蛋白和细胞核蛋白的抽取

采用Byotime细胞浆/核蛋白抽提试剂盒，方法如下:
1）  用PBS洗细胞一次，离心收集细胞，吸尽上清；并取适量的细胞浆蛋白抽提试剂A，在需要加入前加入PMSF至终浓度为1uM。
2）  按2×106细胞加入200uL试剂A,混匀后剧烈震荡5秒钟，冰浴10-15分钟。
3）  加入10uL细胞浆蛋白抽取试剂B, 剧烈震荡5秒钟，冰浴1分钟。
4）  剧烈震荡5秒钟，4℃，12000rpm 离心5分钟。
5）  立即吸取上清至一预冷的0.5mLEppendorf管中，即为抽取得到的细胞浆蛋白。立即使用或-80℃东存。
6）  往上一步的沉淀加入50uL添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。
7）  剧烈震荡15-30秒，然后放回冰浴中，每隔2分钟再高速剧烈震荡15-30秒，共30分钟。
8）  4℃，12000rpm离心10分钟。
9）  立即吸取上清至一预冷的0.5mL Eppendorf管中，即为抽取得到的细胞核蛋白。立即使用或-80℃东存。

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2008-02-21 14:30

线粒体蛋白提取

1.线粒体蛋白抽取液配方(pH7.4)：250mM蔗糖，20mM HEPES，10mM KCl,1.5mM MgCl2,1mM EDTA,1mM EGTA,1mM DTT, 17ug/mL PMSF, 8ug/mL aprotinin, 2ug/mL leupeptin；-20℃保存。
2.步骤：
（1）收集5X10E7细胞，并用 PBS洗细胞；
（2）往细胞沉淀加入2mL上述抽取液，并混匀，可以采用超声或匀浆器方法破膜，程度至苔盼兰染色约90%的细胞为蓝色。
（3）750g，4℃离心5分钟，收集上清，此时沉淀即为细胞膜成分。
（4）13000rpm,4℃离心30分钟, 弃上清，此时沉淀即为线粒体成分。
（5）用100uL列解液重悬沉淀，-80℃保存备用。

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番茄老人

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2008-02-27 11:20

组织：肠黏膜
目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达
应用TRIPURE 提取蛋白质步骤：
含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）
倒转混匀，置室温10min
离心：12000 g，10min，4度，弃上清
加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）
振荡，置室温20min
离心： 7500g，5 min，4 度，弃上清
重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次
沉淀中加入100％乙醇 2ml
充分振荡混匀，置室温20 min
离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀
1％SDS溶解沉淀
离心：10000g，10min，4度
取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT）
存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测
浓度，含量才1mg/ml左右。
解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。

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