【原创】Tricine-SDS-PAGE protocol

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【原创】Tricine-SDS-PAGE protocol

番茄老人

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2008-01-20 23:01

介绍：常规的Tris-SDS-PAGE电泳的只能分辨大分子物质的，而对了相对分子量小的，尤其是10kD以下的蛋白分辨率极低。本人用Tris-SDS-PAGE做一个20KD以下的蛋白结果不是很理想，而且重现性差，因为在这种不连续的缓冲系统中，低分子量的常常堆积在浓缩胶中。而Tricine-SDS-PAGE 可以很好的分离30KD以下的蛋白，而且本人还发现它同样对大蛋白也适用，我用它做过45KD，90KD，120KD左右的蛋白，而且每次上样3uL的Marker跑出来的10条带清清楚楚，几乎是平行的跑下来，常规的Tris-SDS-PAGE加了10uL的效果也没它好，有时越大下面越不清楚，也越窄。如果，有战友做小蛋白的话不妨试试看，下面是我的实验配方和步骤。如有问题还可以跟帖或PM我。
一、缓冲液的配置：
1.正极缓冲液anode buffer（1X）：
0.2M Tris(pH 8.9):12.114g加H20定容至500ml, 4℃保存。
2.负极缓冲液 cathode buffer (1X):
0.1M Tris +0.1M Tricine+0.1%SDS 不用调pH：
6.057gTris+8.96gTricine+0.5g SDS 加H20定容至500ml, 4℃保存。
3. 凝胶缓冲液 gel buffer(G-B, 3X):
36.342gTris+0.3gSDS加H20定容至100ml H20,HCL调pH=8.45,过滤4℃保存。
4. AB-3 储存液(49.5%T,3%Cmixture):
24g丙烯酰胺+0.75g甲叉双丙烯酰胺加H20定容至50ml,过滤4℃保存。
5．AB-6储存液(49.5%T,6%Cmixture):
23.25g丙烯酰胺+1.5g甲叉双丙烯酰胺加H20定容至50ml,过滤4℃保存。
二、具体的步骤：
1.按如下配方制备分离胶和积层胶：

4% 积层胶(3ml) 10%分离胶(8ml)
AB-3(mL) 0.25 --
AB-6(mL) -- 1.6
3×gel buffer(mL) 0.75 2.67
甘油(mL) -- 0.63
H20(mL) 2 3.1
10% APS(uL) 22.5 40
TEMED(uL) 2.25 4

先注入分离胶，待分离胶凝固后（0.5-1小时），注入积层胶。待积层胶凝固后（0.5-1小时）。
2. 上样电泳:
总蛋白取25uL,细胞组分蛋白根据BCA定量后取75ug,加入6×SDS上样缓冲液煮沸5 分钟，12000rpm离心2分钟，取上清进行蛋白电泳。准备电泳时，在电泳槽底部加入正极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽内，在两块胶之间注入负极缓冲液，用30V的电压预电泳10分钟，然后上样。当染料从积层胶进入分离胶后，电压加到90V,继续电泳直到溴酚蓝抵达分离胶底部，断开电源停止电泳。整个电泳过程在冰上或4℃进行。
3．转膜和抗体孵育
1）  电泳近结束时，将裁好的与凝胶尺寸相当的PVDF膜先用甲醇浸透活化后，用去离子水漂洗，然后浸泡在转移缓冲液中。另外，裁剪六张尺寸一致的滤纸连同海绵垫一起置于转移缓冲液中浸泡。
2）  电泳结束后，小心取出凝胶，浸泡于转移缓冲液中，在转移缓冲液中安装转移装置，从负极到正极按如下顺序装置：海绵垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵垫。注意清除各层之间的气泡。转移装置放在搅拌器上并冰浴。连接好电源后，调整电压100V，湿转1-1.5小时。
3）  转膜结束后，用TBST缓冲液漂洗PVDF膜2次，每次5分钟，之后加入20mL封闭液完全浸泡膜，室温平摇2小时。
4）  根据预染Marker显示的分子量，在相应的范围内，将含有目的蛋白的区域剪下，放入预先准备好的含一抗的封闭液中，用塑料袋封好，4℃缓慢侧摇过夜。
5）  取出PVDF膜浸入TBST缓冲液，平摇洗膜三次，每次10分钟。
6）  在封闭液中按1：10000～20000比例加入辣根过氧化物酶标记的二抗，将膜置于其中，室温侧摇0.5-1小时。
7）  取出PVDF膜浸入TBST缓冲液，平摇洗膜四次，每次10分钟。
4.  化学发光显色：
1）  在暗室中，取等量的Stable Peroxide Solution和Luminiol/Enhancer Solution混匀后，将PVDF膜浸泡其中，轻轻晃动，直至可以看到荧光，一般3～5分钟。
2）  将膜取出，用滤纸吸干多余的液体，放入塑料保护膜中。
3）  将封好的膜放入暗盒中，加入X光片，根据荧光的强弱，曝光5秒～1分钟不等。
4）  取出X光片，放入显影液中，直至条带出现，这时可以根据条带的效果，再次调整曝光的时间。
5）  将显影后的X光片用自来水清洗后，放入定影液中定影5～10分钟，再用自来水后晾干、拍照。

参考文献: