【求助】抗体效价下降严重，咋办？

» 医博园 » 免疫学技术版 » 抗原抗体技术

打印话题 寄给朋友

【求助】抗体效价下降严重，咋办？

电灯泡

发贴: 17
积分: 5

得票: 0

状态: 离线

2008-02-15 08:31

腹水出来后，做ELISA试剂盒时发现，室温和4度存放稀释过的抗体，上午和下午的腹水效价差别很大，使结果极不稳定，怎么办？ Sad

请版主和各位大侠多多指教！

如果可以，请楼主反馈结果，本版鼓励结果反馈，并且可以加分。
Smile

医园圣主 edited on 2008-03-19 01:11

• 【公告】2009年医师资格考试的新大纲

luomaiya

发贴: 7
积分: 2

得票: 0

状态: 离线

2008-02-16 09:54

你用什么稀释的抗体，
常规抗体稀释液要加入BSA，
另外还有很多抗体稀释液类的产品，里面还有稳定剂的成分，能够有效的保持效价的稳定

• 【讨论】反复胸闷、气短10个月余,加重伴不能平卧4个月

电灯泡

发贴: 17
积分: 5

得票: 0

状态: 离线

2008-02-16 22:36

我用的PBS，老兄能够具体说明一下抗体稀释液类的产品的名称、BSA的最终浓度吗？

• 【试题】护师资格考试试题

番茄老人

医博园版主

发贴: 1919
积分: 311

得票: 42

状态: 隐身

2008-02-17 17:08

第一个此版求助的，大家赶快帮忙分析啊.
我个人觉得不能仅凭“上午和下午的腹水效价差别很大，使结果极不稳定”就认为是抗体效价下降严重，我们买过来的抗体一般有效期多在6-12月以上，一般不可能在一个上午就出现效价下降。应该考虑你收集的样本，最好保留另外保留一份上午的腹水，留到下午与下午的标本一起做，看看这时候测得的上午腹水样本值跟上午测得差别大不大，如果操作上把握一致的话，两个值应该差别不是很明显，这是如果下午的腹水测出来的值很低的话，那就不是抗体效价的问题了。
抗体稀释液一般试剂盒会提供，我们做免疫荧光 BSA的浓度控制在2-5%，做ELASA我就不清楚了。BSA的作用主要是起到封闭和降低非特异性结合，有时候在做免疫荧光时也会采用羊血清。

天行键，君子以自强不息地势坤，君子以厚德载物

• 浙江大学医学院附属第二医院

电灯泡

发贴: 17
积分: 5

得票: 0

状态: 离线

2008-02-17 23:36

我的抗体的效价很高，特异性也很好，在－20度保存的抗体效价却没有下降，稀释后第一次的效价各测定值接近。。问题是，在研制试剂盒时出现了这一问题，就是在同一块板子上，经过稀释的抗体，上午和下午测的效价，相差的非常大，造成了做抑制实验时的抗体浓度选择的一些问题。由于不能保证抗体的效价的稳定性，试剂盒产品的研制因此处于停顿状态。
我希望luomaiya老兄能给予进一步的解答。
谢谢番茄老人版主关注和热情解答。

• 【共享】学习英文词汇的十个超有用的技巧

番茄老人

医博园版主

发贴: 1919
积分: 311

得票: 42

状态: 隐身

2008-02-18 17:33

你这么说，那就是稀释液的问题了。哈哈，现在好多单位和公司都在研制试剂盒，但是国产的试剂盒问题就是多，也不好使。你最好查查进口ELISA试剂盒抗体稀释液的配方吧，这种东西一般大的公司不会保密的，我们使用的一些进口的试剂盒的好多说明提供配方。

天行键，君子以自强不息地势坤，君子以厚德载物

• 北京朝阳区双桥医院招人

电灯泡

发贴: 17
积分: 5

得票: 0

状态: 离线

2008-02-19 09:58

多谢版主，可以提供一点关于小分子单克隆抗体的稀释液的配制情况吗？先行谢过了！

• 【讨论】反复胸闷、气短10个月余,加重伴不能平卧4个月

番茄老人

医博园版主

发贴: 1919
积分: 311

得票: 42

状态: 隐身

2008-02-19 14:23

我帮你查了一下，配方1.有“10mM的磷酸盐缓冲液内含0.5%的BSA作为标准品及样品的稀释液” ，磷酸盐缓冲液就是PBS.配方2：0.1%BSA+0.1 Tween20+PBS。配方3：2 (w/v)% BSA + 0.05 (v/v)% Tween 20 in PBS pH 7.4（见附件）。因为，我自己没亲手做过，仅供参考。看了一下，这些配方跟免疫荧光的抗体稀释液差不多，而且主要的成分都是一样的，至于浓度，个人觉得不是最重要的，Tween20一般都是0.05-0.1%，BSA 0.5-2%。

给你以下文章希望对你有用：

体外诊断试剂-超级ELISA优化方案

1 竞争抑制ELISA方法的建立

1.1 抗体的酶标记及质量鉴定

本试验采用改良过碘酸钠法将辣根过氧化物酶标记在抗体上[1]，标记完后取上清用Sephedex G200 凝胶层析进行纯化，洗脱液为0.2mol/L pH7.4的PBS，流速为15ml/h，分步收集，每支3ml，以紫外分光光度计测A280吸光度值，以洗脱体积为横坐标，吸光值为纵坐标做图，收集第一峰即为酶标抗体峰。

标记完后用紫外分光光度计在分别在280nm、及403nm处测定酶标记物的A值，计算免疫球蛋白量、摩尔比值、酶结合率以及标记率。

1.2 包被用缓冲液及最适包被抗原浓度的优化

1.2.1 包被缓冲液的优化

包被抗原时，为了得到最佳的包被效果，我们采用了碳酸盐缓冲液（50mM ph9.6 ）、磷酸盐缓冲液（50mM ph7.6）、以及TRIS盐酸缓冲液（50 mM ph7.6）三种缓冲液作为包被液，抗原包被浓度为5ug/ml，及2.5ug/ml,酶标抗体工作浓度为1：400及1：300，用自动酶标仪分析，选择最佳的包被缓冲液系统。同时为了保证缓冲液能够长期保存，我们在包被液中添加了0.01%的硫柳汞作为防腐剂。

1.2.2 最适抗原包被浓度的优化

用优化好的包被缓冲液，将包被抗原（ALB）稀释成0.1ug/ml，1.0ug/ml，2.0ug/ml，4.0 ug/ml，6.0 ug/ml，8.0 ug/ml，10.0 ug/ml等六个浓度，包被微孔板，每孔100ul；竞争抗原浓度为4.0 ug/ml，2.0 ug/ml；酶标抗体稀释度为1：300，经孵育、显色、终止后用自动酶标仪分析。显色的强度在一定范围内与包被的抗原量成正比，但随着包被抗原浓度的增加，显色的强度反而降低，我们选择临界包被值作为包被抗原量。

1.3 封闭液、洗涤液及保护液的优化

1.3.1 封闭液的优化

采用文献报道的方法进行封闭，其封闭液的组成为：10mM磷酸盐缓冲液含1%的牛血清白蛋白（BSA）。

1.3.2 洗涤液的配制

采用文献报道的方法配制洗涤液。

1.3.2 酶标板保护液的优化

酶标板经过封闭后在低温下仅能存放2周左右，为了延长固相酶标板上抗原的稳定性，我们增加了一步保护酶标板的程序。在10mM的磷酸盐中加入适量的糖、无关蛋白质、庆大霉素以及二价金属离子，作为酶标板保护剂，在封闭完后加入保护液于4℃冰箱中孵育过夜，同时与未做保护的酶标板进行对照，然后将保护的及未保护的酶标板置于37烘箱中放置15天，考察保护液对酶标板的稳定性的影响。

1.4 酶标抗体稀释度的优化

抗原包被浓度为4ug/ml,将酶标抗体做系列稀释：1：100，1：200；1：300；1：400；1：500；1：600；1：1000；经孵育、洗涤后、显色终止后，用自动酶标仪分析，选择A值为1.5左右的酶标抗体稀释度为最适工作浓度。

1.5 酶标抗体保护液的优化

低浓度的酶标抗体极容易受到高温、微生物、以及蛋白酶的影响而失活，严重影响产品的货架期，过去通常将酶标抗体冻干保存，然而这样的保存，不仅由于在冻干的过程中会影响酶标抗体的活性，而且在临床应用中颇为不便。适当的缓冲液以及添加无关蛋白质、糖、防腐剂以及一些含氨基的化合物等都会对对酶标抗体的活性起一定的保护作用，因此我们设计了一组保护剂用于保护酶标抗体，与未添加任何糖蛋白的酶标抗体做对照，将经保护的酶标抗体及未保护的酶标抗体置于37℃烘箱中放置6天，考察保护液对酶标抗体的影响。

1.6 底物液的优化

常用的作为酶联免疫吸附试剂有OPD和TMB系统，由于 OPD有致癌的危险性以及用前需要溶解等诸多缺点，因此我们选用TMB作为底物系统，采用文献报道的方法：取适量的TMB溶解在DMSO中，然后加入适量的超纯水，配制作为底物B液；溶解适量的过氧化氢尿素于100mM磷酸-柠檬酸缓冲液中，配制作为底物A液，用前将底物A液及底物B液等体积混合。

在文献报道的基础上，我们适当调整了TMB的用量以及过氧化氢尿素的用量，并加入了酶促进剂，与文献报道的底物进行比较。实验方案为：将活化的辣根过氧化物酶分别作1：1000；1：10000；1：100000；1：200000；1：400000；1：800000等系列稀释，比较两种不同配方的底物的灵敏度。

1.7 标准品及样品稀释液

我们采用10mM的磷酸盐缓冲液内含0.5%的BSA作为标准品及样品的稀释液。

1.8 抗原抗体反应时间的优化

抗原抗体反应会随着时间的增加，反应量也增加，但达到一定的时间后，反应即达到平衡，我们取反应10min，20min，30min，40min，50min，60min，

70min,90min等8个点进行比较，以确定最佳抗原抗体反应时间。

1.9 底物作用时间的优化

在其它条件相同的情况下，我们取5min,10min,15min,20min,25min,30min,35min

40min,50min,60min,80min等11个时间点进行比较，确定最佳的底物作用时间。

1.10 剂量反应曲线的建立及曲线拟合方式的确定

在其他参数均已经优化完成的情况下，将抗原标准品用标准品稀释液依次稀释为：160mg/L,80mg/L，40mg/L，20mg/L，10mg/L，5mg/L，2.5mg/L，1.25mg/L，0.625mg/L，

0.3125 mg/L，0.156 mg/L，0.780 mg/L等12个稀释度，同时设置阴性和空白对照，加入已包被好抗原的酶标板中，同时加入酶标抗体，经孵育、显色、终止后用自动酶标仪分析，采用文献报道的4P对数拟合曲线。